WB操作流程

一樣品準備
1 細胞樣品：將需要抽提的蛋白的細胞從培養箱中取出，吸去培液，適量預冷的1×PBS洗滌2次，吸去PBS，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液，4℃充分裂解細胞，將細胞刮入1.5ml EP管中，95℃以上加熱10分鐘，12000g離心 10 分鐘，取上清，進行蛋白質定量后貯存于 -80℃冰箱。
2 組織樣品：
新鮮組織：將組織剪成細小的碎片，按每20mg組織加入150-250μl裂解液的比例加入裂解液（裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑），勻漿器勻漿直至完全裂解。裂解后的樣品4℃ 12000g 離心15分鐘，取上清，進行蛋白質定量后貯存于-80℃冰箱。
冷凍組織：于-80℃冰箱中取出適量的組織在液氮中迅速研磨成粉末，將研磨好的粉末轉移到含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液的離心管中，4℃ 12000g 離心15分鐘，取上清，進行蛋白質定量后貯存于-80℃冰箱。
蛋白定量
1 標準曲線的繪制：取一塊酶標板，按照下表加入試劑

孔號	1	2	3	4	5	6	7	8
蛋白標準液（μl）	0	2	4	6	8	12	16	20
去離子水（μl）	20	18	16	14	12	8	4	0
對應蛋白濃度（μg/μl）	0	0.05	0.1	0.15	0.2	0.3	0.4	0.5

2. 根據樣品數量，將BCA試劑A與試劑B按體積比為50:1配制適量BCA工作液，充分混勻；
3. 各孔加入180μl BCA工作液；
4. 把酶標板放在振蕩器上振蕩30sec，37℃放置30分鐘，然后在562nm下測定吸光度。以吸光值為橫坐標，蛋白濃度（μg/μl）為縱坐標，繪出標準曲線；
5. 在酶標板中加入2μl待測蛋白和18μl PBS（稀釋10倍），加入180μl BCA工作液，把酶標板放在振蕩器上振蕩30sec，37℃放置30分鐘，然后在562nm下測定吸光度，每個樣本重復做兩個孔。
6. 根據所測樣品的吸光值，在標準曲線上即可查得相應的蛋白濃度（μg/μl），乘以樣品稀釋倍數（10）即為樣品實際濃度（單位：μg /μl）。
三 PAGE膠的制備
1. 下層分離膠的制備
根據目的蛋白的分子量選擇不同的凝膠濃度，高分子量蛋白用低濃度膠，低分子量蛋白用高濃度膠分離。不同濃度的分離膠按下表進行配制，待下層膠凝固后進行上次濃縮膠的配制。

2. 上層濃縮膠的配制
根據需要按下表配制濃縮膠，并插好梳子。

四上樣及電泳
1. 上樣
每孔上樣量為20-40μg蛋白，可以根據實驗要求加大上樣量。根據蛋白定量結果取所需蛋白加入適量上樣緩沖液，沸水浴10min后離心取上清上樣。將配制好的PAGE膠放入電泳槽中，加入適量電泳緩沖液，取下梳子用槍輕輕吹打加樣孔，避免孔內有余膠殘留影響上樣。將準備好的樣品用加樣槍慢慢加到對應的孔內，注意勿溢出加樣孔。
2. 電泳
一般濃縮膠80V 20分鐘，分離膠120V 60分鐘，可以根據具體實驗要求調整電壓和時間。當染料到達膠底部時切斷電源，停止電泳，進行下一步轉膜。
五轉膜
    轉膜分為濕轉和半干轉，一般分子量小于100KD選擇半干轉。濕轉膜三明治排列為：海綿/慮紙/膠/膜/慮紙/海綿，全部緊密排列，特別是膠/膜之間不能留有氣泡，三明治安放的方向為負極為膠，正極為膜，帶負電的蛋白由負極向正極方（膜）遷移。30V轉膜30分鐘，可以根據膠的厚度以及蛋白的大小增加轉膜時間。標準的電轉緩沖液為1X Tris-glycine buffer 不含SDS，但加入20%甲醇，如果轉膜的蛋白分子量大于80KD，則推薦加入SDS 使之終濃度為0.1%。
    半干式轉膜中，三明治的排列為：/慮紙/膠/膜/慮紙，用電轉緩沖液浸濕后，直接置于電轉儀的正負極之間。膠于負極而膜置于正極。半干式的電轉緩沖液不同于濕式的電轉緩沖液，推薦為：48 mM Tris, 39 mM glycine, 0.04% SDS, 20%甲醇。25V轉膜30分鐘即可。轉膜前將PVDF膜在甲醇中浸泡1-2 分鐘，再孵育于冰冷的電轉緩沖液中5 分鐘，膠也需在冰冷的電轉緩沖液中平衡3-5 分鐘，否則轉膜時會導致條帶變形。
六膜上蛋白的檢測
    為檢測轉膜是否成功，可用麗春紅染色，麗春紅染色工作液：2%的麗春紅貯備液1：10 稀釋，即加9 倍的ddH₂O
染色方法：將膜放入TBST 洗一次，再置于麗春紅染色工作液中,在室溫下搖動染色5 分鐘，大量的水洗膜直至水變清無色蛋白條帶清晰，（膜也可以用TBST 或水重新洗后再進行染色）PVDF 膜需用甲醇再活化后用TBST洗后進行封閉。
七膜的封閉及抗體孵育
1. 封閉：5%脫脂奶粉（檢測磷酸化蛋白用BSA）室溫封閉1小時或4℃過夜。
2. 一抗：不同公司生產的一抗濃度不同，根據說明書稀釋抗體，抗體加入封閉液中稀釋到所需濃度，和膜室溫孵育2小時或4 ℃孵育過夜。
3. 二抗：孵育一抗的膜用TBST洗滌3次，每次5min。隨后根據用量，ECL法按10ml抗體稀釋液加入5μlHRP標記二抗（1:2000），與膜374℃孵育1h。用TBST洗滌3次，每次5min。
八顯色
ECL化學發光檢測：配制ECL發光液，根據用量，取ECL發光液A和B等量混勻，加在膜的正面暗室避光5分鐘。倒掉顯色液，用紙小心吸取顯色液，在上面蓋上一層平整的透明紙。暗室中打開紅外燈，取出感光膠片做好標記，輕輕放在膜上，顯色30-60s，拿開膠片立即完全浸入顯影液中1-2min，在放入定影液中1min，離開暗室觀察結果?？梢愿鶕l帶強弱再次感光或減短感光時間已達到理想結果。