可能影響酶免疫測(cè)定ELISA結(jié)果的標(biāo)本內(nèi)源性干擾因素

 
內(nèi)源性干擾因素一般包括類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、高濃度的非特異免疫球蛋白、異嗜性抗體、某些自身抗體、因使用鼠抗體治療或診斷誘導(dǎo)的抗鼠Ig抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)等。在日常的臨床血清（漿）標(biāo)本中，有相當(dāng)比例不同程度的含有上述各種干擾物質(zhì)，從而導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果的假陽性。
1.類風(fēng)濕因子（rheumatoid factors,RF）在類風(fēng)濕患者、其他疾病以及正常人血清中,常含有較高或不同濃度的RF，RF一般為TgM型，亦有IgG和IgA型，RF具有與變性IgG產(chǎn)生非特異結(jié)合的特點(diǎn)，因?yàn)樵贓LISA測(cè)定中，其可與固相上包被的特異抗體IgG以及隨后加入的酶標(biāo)的特異抗體IgG結(jié)合，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。尤其是在捕獲法IgM型特異抗體的測(cè)定中表現(xiàn)最為明顯，因?yàn)榇藭r(shí)固相包被的抗體為抗人弘鏈抗體，IgM型RF的存在可使其大量結(jié)合于固相。為避免RF對(duì)ELISA測(cè)定的干擾，通常可以采取下述措施：
(1)稀釋標(biāo)本：這在判斷急性病原體感染的特異IgM抗體如抗HAVIgM，抗HBclgM， TORCH的IgM抗體檢驗(yàn)等尤為有用。因?yàn)榧毙愿腥緯r(shí)，血循環(huán)中特異的IgM抗體滴度通常很高，而RF滴度通常相對(duì)要低得多。因此，在測(cè)定前對(duì)標(biāo)本進(jìn)行稀釋，特異的IgM因高滴度存在仍可檢出，而非特異的RF則會(huì)因?yàn)橄♂屪兂煞浅５偷牡味龋瑥亩鴮?duì)測(cè)定幾乎不產(chǎn)生干擾。現(xiàn)在，有些特異IgM檢測(cè)ELISA試劑盒不要求稀釋標(biāo)本，直接檢測(cè)，這樣雖然方便了實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員的操作，但容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，并且由于某些慢性感染，如HBV的感染，血循環(huán)中抗HBelgM可持續(xù)以一定的滴度存在，標(biāo)本不做稀釋即進(jìn)行檢測(cè)，即可出現(xiàn)陽性結(jié)果，從而失去抗HBclgM用于HBV急性感染的診斷價(jià)值。因此，在臨床實(shí)驗(yàn)室，一定要使用要求對(duì)標(biāo)本做1:1000稀釋的試劑盒進(jìn)行檢驗(yàn)，從而保證相應(yīng)檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果的可靠性及臨床應(yīng)用價(jià)值。
(2)改變酶標(biāo)抗體：由于RF結(jié)合的是IgG的Fc片段，如果將待酶標(biāo)的抗體的F，片段酶切夫除，僅留下具有特異結(jié)合功能的F(ab’)2部分標(biāo)記酶，則在測(cè)定中即可避免RF的干擾。
(3)標(biāo)本中RF用變性IgG預(yù)先封閉：將經(jīng)熱變性（63℃，10min）的動(dòng)物如兔、羊等的IgG加入到標(biāo)本稀釋液中，或是將該變性IgG連接至一顆粒固相如聚苯乙烯微球或微孔，然后加入臨床血清標(biāo)本，反應(yīng)后，再吸出標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。此外，在測(cè)定特異IgM時(shí)，也可使用抗人IgG去除臨床標(biāo)本中RF和IgG。
(4)測(cè)定抗原時(shí)，可在標(biāo)本中加入可使RF降解的還原劑：如2—巰基乙醇。2—巰基乙醇等還原劑可使抗體內(nèi)的巰基裂解，因而可以去除RF的干擾，但只適用于抗原測(cè)定。
(5)包被或酶標(biāo)二抗使用特異的雞抗體IgY：RF不與雞IgY反應(yīng)，如果包被和酶標(biāo)二抗均為雞IgY抗體，則不受標(biāo)本中RF的干擾。
2.補(bǔ)體在固相酶免疫測(cè)定中，來自哺乳動(dòng)物的固相特異抗體和酶標(biāo)二抗均有激活人補(bǔ)體系統(tǒng)的功能。一方面，固相抗體和酶標(biāo)二抗可因?yàn)槠湓诠滔辔郊敖Y(jié)合過程中，抗體分子發(fā)生變構(gòu)，從而其F, 段的補(bǔ)體C1，結(jié)合位點(diǎn)被暴露出來，這樣C1，就成為一個(gè)中介物將二者交聯(lián)起來，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。另一方面，固相抗體也會(huì)因?yàn)榛罨a(bǔ)體的結(jié)合，封閉抗體的抗原表位結(jié)合能力，而引起假陽性結(jié)果或使定量測(cè)定結(jié)果偏低。由補(bǔ)體引起的干擾可通過下述方法避免：
(1)對(duì)臨床血清標(biāo)本加熱滅活補(bǔ)體：采用56~C30min加熱可使標(biāo)本中的補(bǔ)體C1。滅活。
(2)包被或酶標(biāo)二抗使用特異的雞抗體：雞抗體不激活人的補(bǔ)體系統(tǒng)，因此，使用特異的雞抗體，不會(huì)出現(xiàn)因補(bǔ)體激活而存在的假陽性和假陰性干擾。
3.異嗜性抗體（heterophilieantibodies）人類血清中含有抗嚙齒類動(dòng)物（如鼠、馬、羊等）的免疫球蛋白（lg）的抗體，即天然的異嗜性抗體。有研究表明，天然的異嗜性抗體（lgG）可分為兩類，一類（85%的假陽性由其引起）可結(jié)合于山羊、小鼠、大鼠、馬和牛IgG的Fab區(qū)域，但不與兔IgG的Fab區(qū)結(jié)合。另一類（15%的假陽性由其引起）可結(jié)合于小鼠、馬、牛和兔IgG的Fc區(qū)表位，但不與山羊和大鼠IgG的Pc區(qū)表位結(jié)合。異嗜性抗體可通過交聯(lián)固相和酶標(biāo)的單抗或多抗而出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。由異嗜性抗體引起的干擾可通過下述方法避免：
(1)使用特異的兔F(ab’)2。片段作為固相或測(cè)定酶標(biāo)抗體。
(2)在標(biāo)本或標(biāo)本稀釋液中加入過量的動(dòng)物Ig，封閉可能存在的異嗜性抗體。但加入量不足或亞類不同時(shí)無效。
(3)使用靶特異的非Ig親和蛋白（affibody）替代固相或酶標(biāo)抗體之一。采用噬菌展示來自單個(gè)金黃色葡萄球A蛋白（SPA）聯(lián)合文庫的人IgA結(jié)合親和蛋白，用于IgA的測(cè)定，不受異嗜性抗體的影響。
4.因使用鼠抗體治療或診斷誘導(dǎo)的抗鼠Ig抗體在臨床上，有嘗試使用鼠源性單克隆抗體進(jìn)行靶向治療，及使用放射性核索標(biāo)記鼠源性單克隆抗體進(jìn)行影像診斷等，均有可能使相應(yīng)患者體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體。這種抗鼠抗體對(duì)使用鼠源性單克隆抗體的酶免疫測(cè)定，可產(chǎn)生假陽性結(jié)果。由抗鼠抗體引起的干擾可通過下述方法避免：
(1)使用的特異的抗體（F，。bf）:片段作為固相或測(cè)定酶標(biāo)抗體。
(2)在標(biāo)本或標(biāo)本稀釋液中加入過量的鼠Ig，封閉可能存在的抗鼠抗體。
(3)使用特異的雞抗體IgG作為固相和測(cè)定抗體。雞IgG不與人抗鼠抗體反應(yīng)。因而，用其作為固相或酶標(biāo)抗體不會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果。
5.自身抗體   自身抗體如抗甲狀腺球蛋白、抗胰島索等，能與其相應(yīng)靶抗原結(jié)果形成復(fù)合物，在ELISA方法中可干擾相應(yīng)原抗體的測(cè)定。為避免以上情況出現(xiàn)，可在測(cè)定前用理化方法將其解離。
6. 溶菌酶溶菌酶可與等電點(diǎn)較低的蛋白有強(qiáng)的結(jié)合能力。免疫球蛋白等電點(diǎn)約為5，因此，在雙抗體夾心法ELISA測(cè)定中，溶菌酶可在包被的IgG和酶標(biāo)的IgG間形成橋接，從而導(dǎo)致假陽性。因此，為保證ELISA測(cè)定的可靠性，有必要從標(biāo)本中去除溶菌酶或?qū)⑵浞忾]，Cu2+離子和卵白蛋白可有效地封閉溶菌酶，防止其連接IgG。
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