虎外周血淋巴細胞分離液實驗方法
 
 
本品用于分離虎外周血淋巴細胞
 
技術(shù)文檔編號：TBD0017SOP
 
【產(chǎn)品規(guī)格】
 
200ml/Kit
 
【產(chǎn)品組成】
 
為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下：
 

	名稱	產(chǎn)品編號	規(guī)格
A	XXXX 動物外周血淋巴細胞分離液		200ml
B	樣本稀釋液（贈品）	2010C1119	200ml
C	清洗液（贈品）	2010X1118	200ml
D	說明書		1 份

 
【實驗前準備】
 
適用儀器：最大離心力可達 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機
 
【檢驗方法】
 
全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行。
 
首先取抗凝血按體積比 1:1 的比例與樣本稀釋液（產(chǎn)品編號：2010C1119）混勻，根據(jù)
 
稀釋后的樣本量大小，分以下兩種情況：
 
情況 A：稀釋后的血液樣本量小于 5ml 時，實驗方法如下：
 

• 取一支 15ml 離心管，先加入與稀釋后樣本等量的分離液（注：分離液最少不得少于 3ml）。

 

• 用吸管小心吸取稀釋后的血液樣本加于分離液液面上，400-500g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到最佳分離效果）。

 

• 離心后，此時離心管中由上至下分為四層。第一層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。

 

• 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細胞層到另一 15ml 離心管中，往所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細胞。
• 250g，離心 10min。

 

• 棄上清。

 

• 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細胞。

• 250g，離心 10min。

 

• 重復 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實驗所需相應液體重懸細胞。

 
情況 B：稀釋后的血液樣本量大于等于 5ml 時，實驗方法如下：
 

• 取一支適當?shù)碾x心管，先加入與稀釋后樣本等量的分離液。

 

• 將經(jīng)稀釋后的血液樣本小心加于分離液之液面上，550-650g（最大離心力可至 1000g），離心 20-30min。（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到最佳分離效果。加入血液樣本后，樣本及分離液總體積不得超過離心管總體積的三分之二）。

 

• 剩余步驟同“情況 A”中步驟 3 至步驟 9。

 
分離圖例
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
【注意事項】
 

• 全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行。為獲得最佳的實驗結(jié)果，最好在取血 2h 內(nèi)進行實驗，血液存放時間越長，細胞分離效果越差。血液放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達到分離目的。

 

• 本實驗最好不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應使用無靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因為靜電作用將導致細胞貼壁、堿處理的玻璃表面會變成毛面，影響細胞分離效果。

 

• 吸取過多的淋巴細胞層及分離液層會導致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使混雜的粒細胞數(shù)量增加。

 

• 吸取過多的淋巴細胞層上層溶液會導致血漿蛋白及血小板混雜。

 

• 如所實驗后細胞得率或活性過低，請聯(lián)系上海研謹生物技術(shù)人員以尋求幫助。

 
【儲存條件及有效期】
 
常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟
 
封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
 
【參考值（參考范圍）】
 
本實驗淋巴細胞提取率及純度均大于 80%。
 
下表為成年人外周血中各種細胞的數(shù)量及比例，用戶可適當進行參考。
 

	紅細胞		白細胞		血小板
		（4.0-10.0）×109
含量（個/L）	（4.0-5.5）×1012	中性粒細胞	淋巴細胞	單核細胞	（1.0-3.0）×1011
		50%-70%	20%-40%	3%-8%
【相關(guān)實驗技術(shù)方案】

 

• 所獲得淋巴細胞的培養(yǎng)技術(shù)。

 

• 所獲得淋巴細胞的核酸提取技術(shù)。

 

• 所獲得淋巴細胞的鑒定方法A.流式細胞技術(shù)B.免疫組化技術(shù)

C.原位雜交技術(shù)
 
D.PCR 技術(shù)
 
 

【可能存在的問題及解決方法】
1.	由于血液粘度、細胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：
	出現(xiàn)情況	出現(xiàn)原因		建議解決方案
離心后目的細胞存在于血漿層或稀釋液層		轉(zhuǎn)速過小或離心時間過短		適當增減轉(zhuǎn)速
	離心后目的細胞存在于分離液中	轉(zhuǎn)速過大或離心時間過長
	離心后白環(huán)層彌散	細胞密度過大		調(diào)整細胞密度
	離心后白環(huán)層太淺或看不見	細胞密度過小
2.	本分離液分離細胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地