cck-8試劑盒、細胞增殖、細胞毒性檢測試劑盒 CCK-8試劑盒 Cell Counting Kit-8 CK04 檢測原理： ◆ Cell Counting Kit簡稱CCK8,(CCK-8/WST-8)試劑盒，是一種基于WST-8（化學名：2-(2-甲氧基-4-硝***基)-3-(4-硝***基)-5-(2,4-二磺基***)-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。 ◆ WST-8屬于MTT的升級產(chǎn)品，工作原理為：在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物（formazan）。顏色的深淺與細胞的增殖成正比，與細胞毒性成反比。使用酶標儀在450mM波長處測定OD值，間接反映活細胞數(shù)量。 ◆ CCK法應用非常廣泛，如藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗以及生物因子的活性檢測等。 CCK-8試劑盒 Cell Counting Kit-8 CK04 CCK方法的優(yōu)勢： ◆ 表1 CCK法與其他細胞增殖/毒性檢測方法的優(yōu)勢比較 檢測方法 MTT法 XTT法 WST-1法 CCK法 甲臜產(chǎn)物的水溶性 差（需加有機溶劑溶解再檢測） 好 好 好 產(chǎn)品性狀 粉末 2瓶溶液 溶液 1瓶溶液 使用方法 配成溶液后使用 現(xiàn)配現(xiàn)用 即開即用 即開即用 檢測靈敏度 高 很高 很高 高 檢測時間 較長 較短 較短 最短 檢測波長 560-600nm 420-480nm 420-480nm 430-490nm 細胞毒性 高，細胞形態(tài)完全消失 很低，細胞形態(tài)不變 很低，細胞形態(tài)不變 很低，細胞形態(tài)不變 試劑穩(wěn)定性 一般 較差 一般 很好 批量樣品檢測 可以 非常適合 非常適合 非常適合 便捷程度 一般 便捷 便捷 非常便捷 ◆ 酚紅和血清對CCK法的檢測不會造成干擾； ◆ 細胞毒性非常低，因此加入WST-8顯色后，可以在不同時間反復用酶標儀讀數(shù)從而找到最佳測定時間。 CCK法的操作步驟（更多內容請見說明書）： 實驗一：細胞活性檢測 1、在96孔板中接種細胞懸液（100μL/孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)（37℃,5% CO2）。 2、向每孔加入10 μL CCK溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數(shù)）。 3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內孵育1-4小時。 4、用酶標儀測定在450nm處的吸光度。 5、若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時內測定，吸光度不會發(fā)生變化。 實驗二：細胞增殖-毒性檢測 1、在96孔板中配置100μL的細胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預培養(yǎng)24小時（37℃，5% CO2）。 2、向培養(yǎng)板加入10μL不同濃度的待測物質。 3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當?shù)臅r間（例如：6、12、24或48小時）。 4、向每孔加入10μL CCK溶液（注意不要再孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數(shù)）。 5、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內孵育1-4小時。 6、用酶標儀測定在450nm處的吸光度。 7、若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時內測定，吸光度不會發(fā)生變化。 注意：如果待測物質有氧化性或還原性的話，可在加CCK之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。 活力計算： 細胞活力*（％）=[A(加藥)-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）] ×100 A（加藥）：具有細胞、CCK溶液和藥物溶液的孔的吸光度 A（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK溶液而沒有細胞的孔的吸光度 A（0加藥）：具有細胞、CCK溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度 *細胞活力：細胞增殖活力或細胞毒性活力 CCK-8試劑盒 Cell Counting Kit-8 CK04保存條件： 4℃避光保存一年有效，-20℃避光保存兩年有效。 Cell Counting Kit-8（CCK-8試劑盒）是由同仁化學研究所（Dojindo）開發(fā)的檢測細胞增殖、細胞毒性的試劑盒，為MTT法的替代方法，試劑盒中采用自己開發(fā)的水溶性四唑鹽-WST-8，在美國，歐洲等國家地區(qū)均持有專利，同仁化學研究所于2006年在中國獲得了WST-8的注冊商標。 CCK-8法與普通的MTT法相比，具有顯著特點： ★靈敏度高，數(shù)據(jù)可靠，重現(xiàn)性好 ★操作簡便，省時省力 ★水溶性，不需要換液，尤其適合于懸浮細胞 ★無需***性同位素和有機溶劑，對細胞毒性低 ★為1瓶溶液，毋需預制，即開即用 ★適合于高通量藥物篩選 CCK-8用途：藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗 CCK-8試劑盒在國內知名科研院所、重點大學、三甲醫(yī)院被廣泛應用，國際認可度高，使用CCK-8發(fā)表的中外文獻達600多篇，其中截止08年底SCI影響因子IF＞10分的論文有37篇，最高IF26.5分 [Heterozygosity with respect to Zfp148 causes complete loss of fetal germ cells during mouse embryogenesis,Nature Genetics 33, 172 - 176 (01 Feb 2003)] CCK-8試劑與MTT等方法靈敏度比較 CCK-8試劑毒性：CCK-8和其他檢測方法對比可以得出——CCK-8對細胞幾乎無毒性，不傷害細胞，細胞可重復利用