文章背景簡介

耐熱的漢遜酵母Ogataea polymorpha是一種具有基礎研究和應用價值的微生物。它已成為研究甲醇利用、細胞自噬、硝酸同化的重要有機體。它的一個吸引人的特性是能夠通過非同源末端連接（NHEJ）將多達100個目標拷貝基因整合到基因組中。此外，它可以利用人體低聚糖合成糖蛋白，還可以在高達50℃的溫度下生長，從而可降低工業發酵昂貴的冷卻成本。

CRISPER－Cas9輔助基因組編輯技術的研究進展為建立多重基因組工程提供了一種有效的途徑。其基本原理是：反式激活crRNA：crRN雙鏈直接引導Cas9蛋白與目標DNA序列結合，然后Cas9蛋白在PAM上游的三個核苷酸中產生雙鏈斷裂（DSB）。DSB可以通過非同源末端連接插入或修復，也可以通過同源重組來進行精準編輯，如基因敲除，點突變等。

核糖體DNA（rDNA）是編碼核糖體RNA的DNA序列。在酵母中，rDNA通常由大量的相同重復序列組成。在O． polymorpha中，rDNA包含50－60個8kb的重復單元。在釀酒酵母（S． cerevisiae）中，rDNA位點由150－200個重復序列組成，重復序列為9．1kb。近年來，rDNA重復序列已成為一些酵母菌多拷貝基因整合的目標位點。

2018年6月，中國科學院微生物學研究所病原微生物學與免疫學重點實驗室的Laiyou Wang等人，在《Biotechnology for Biofuels》雜志（IF2018＝5．497；工程技術 1區）發表了題為“Efficient CRISPR－Cas9 mediated multiplex genome editing in yeasts”的文章。

所用到的主要方法

1．活細胞的制備及轉化

2．質粒構建和模板編輯

3．編輯效率計算：

編輯效率＝所需突變體數目／總被測菌落數

4．流式細胞儀分析

5．基因拷貝數估計

6．穩定性檢測

7．搖瓶發酵

8．產品濃度分析：HPLC

文章主要內容摘要

在本研究中，作者發展了一種CRISPR－Cas9輔助多重基因組編輯（CRISPR–Cas9－assisted multiplex genome editing，CMGE）方法，包括多重基因敲除、多位點（ML）和多拷貝（MC）整合方法。在CMGE的基礎上，對漢遜酵母（O．polymorpha）進行了基因敲除、整合和精確點突變等基因組修飾。采用CMGE－ML整合方法，在白藜蘆醇生物合成途徑三個不同的位點同時整合 橙色滑柱菌（Herpetosiphon aurantiacus）的酪氨酸解氨酶（TAL）基因，擬南芥的4－香豆酰CoA連接酶（4CL）基因和釀酒葡萄的芪合酶（STS）基因，成功實現白藜蘆醇在O． polymorpha內的生物合成。采用CMGE－MC方法，將不同拷貝數的融合基因表達盒Psctef1－TAL－Psctpi1－4CL－Psctef2－STS整合到基因組中，白藜蘆醇產量比單拷貝整合提高了20倍，達到97．23±4．84 mg／L。此外，本研究還利用CMGE－MC技術分別整合了人血清白蛋白（HSA）和大腸桿菌賴氨酸脫羧酶（cadA）基因，實現了人血清白蛋白和尸胺的生物合成。除漢遜酵母外，本研究還在釀酒酵母內也成功地建立了 CMGE－MC方法。CMGE方法為O． polymorpha和其他酵母的基因工程和合成生物學研究提供了一個有效的工具。

在釀酒酵母中同步敲除多基因的CRISPR－Cas系統