前言

近年來,過繼性T細胞(ACT)免疫治療在開拓和加速腫瘤治療領域方面顯示出了巨大的潛力,并在臨床實踐中取得了前所未有的突破。CRISPR-CAS9系統作為一種多用途的基因編輯技術,為有效地創新腫瘤研究和腫瘤治療奠定了堅實的基礎。CRISPR/Cas9與腫瘤過繼性T細胞免疫治療這兩項腫瘤研究和治療革命性技術的結合,可能進一步拓寬免疫治療在更多腫瘤患者中的應用。

CRISPR/CAS9系統

CRISPR/Cas9系統本質上是一種針對外源DNA的細菌防御機制。CRISPR最初發現于20世紀80年代末,是一種由交替重復和非重復DNA序列組成的不尋常的遺傳結構�；�因組分析表明,CRISPR和Cas蛋白作為獲得性免疫系統發揮作用,并通過RNA引導的DNA切割系統保護原核DNA免受噬菌體和質粒DNA的攻擊。

當外源DNA侵入細菌時,其DNA片段作為間隔子并入CRISPR位點。然后將該位點轉錄到CRISPR前RNA(crRNA),該RNA附著到組成性形成的反式激活RNA(tracrRNA)上,由CRISPR相關蛋白修飾成gRNA。當gRNA與非活性Cas9復合物的REC I結構域結合時,該復合物被激活,導致gRNA及其互補單鏈DNA形成異源雙鏈。Cas9的HNH和RuvC核酸酶域隨后分別切割互補和非互補DNA鏈。

Cas9屬于1類CRISPR-Cas系統的II型,來源于化膿鏈球菌。Cas9與靶序列的偶聯需要一個原間隔基鄰近基序(PAM),一個小的入侵基因組中的3-8bp DNA序列,PAM在區分細菌自身和非自身DNA以及成功結合Cas9方面至關重要。

與ZFN和TALEN不同,ZFN和TALEN依賴于每個特定基因序列的精細蛋白質產物,CRISPR/Cas9系統依賴于gRNAs,使其成為更靈活的平臺。Cas9蛋白保持不變,而gRNA可以方便地根據每個基因進行定制。CRISPR/Cas9系統的另一個優點是,它使得在多個基因座上同時進行基因編輯成為可能,與以前的系統相比,它提供了一個更高效和可擴展的平臺。

CRISPR/CAS9在CAR-T治療中的應用

目前,CAR-T細胞治療已經在血液惡性腫瘤中顯示出前所未有的療效。然而盡管已經取得了令人印象深刻的臨床結果,但由于多種原因,許多患者仍然無法從CAR-T細胞治療中獲益。首先,制造T細胞的個性化方法費時且昂貴,這阻礙了許多患者,尤其是疾病快速進展的患者充分利用這種免疫療法;第二,在生產過程中,淋巴細胞減少的患者很難產生足夠高質量的T細胞,即使患者獲得足夠的免疫細胞,這些細胞也可能無法完成整個制造過程;最后,自體CAR-T產品的異質性可能會導致不可預測和可變的臨床結果。

CRISPR/Cas9產生通用異基因CAR-T細胞

為了克服限制CAR-T細胞治療廣泛應用的障礙,人們提出了多種治療策略。最可行和持久的方法之一是從健康捐贈者中產生異基因通用CAR-T細胞。與自體CAR-T細胞相比,“現成”的同種異體CAR-T細胞具有許多潛在優勢,包括可立即為急需的患者提供冷凍保存的CAR-T細胞、首次輸注或再給藥的足夠數量以及CAR-T細胞生產標準化�？紤]到供者T淋巴細胞上存在內源性HLA和TCR,通用產品的最大挑戰是同種異體反應和移植物抗宿主病(GVHD)的潛在風險。

隨著基因編輯技術的進步,人們逐步實現了內源性TCR的根除。通過鋅指核酸酶(ZFNs)和轉錄激活物樣效應器核酸酶(TALENs),人們都制造出了敲除TCR的CAR-T細胞。然而,完全同種異體CAR-T細胞的產生需要同時敲除TCR和HLA分子并轉導CAR,這需要一種更高效和精確的基因編輯技術來實現。

與ZFNs和TALENs相比,CRISPR/Cas9具有良好的柔性和高效性,在異基因CAR-T細胞的制備中有著廣泛的應用。CRISPR/Cae9可以同時高效地敲除多個基因位點。Ren等人使用CRISPR/Cas9產生同時敲除內源性TCR、HLA-I和PD-1的CAR-T細胞,其在體外和動物模型中顯示出強大的抗腫瘤活性。

CRISPR/Cas9削弱抑制性檢查點分子

盡管在血液系統惡性腫瘤中取得了顯著的成功,但由于免疫抑制性腫瘤微環境和T細胞衰竭,仍有許多患者的CAR-T細胞治療不理想。由于共抑制分子(如PD-1、CTLA-4、LAG-3和TIM-3)在T細胞功能障礙中的重要作用,CRISPR/Cas9也被用于破壞這些抑制基因以增強CAR-T細胞功能。

CRISPR/Cas9促進T細胞細胞因子的產生

細胞因子在調節T細胞的功能中是必不可少的。TCR刺激的強度極大地影響細胞因子的分泌。結構性表達IL-12和IL-15的CAR-T細胞可以提高抗腫瘤活性和長期持久性。此外,已證明IL-18可促進IFN-γ的產生和CAR-T細胞增殖。因此,可以利用病毒轉導人工誘導細胞因子的產生;然而,細胞因子過度表達可能導致T細胞耗竭或自身免疫。CRISPR/Cas9也可用于在特定位點敲入所需的細胞因子基因,并使其分泌受到內在啟動子的嚴格控制。

二酰甘油激酶(DGK)是下調二酰甘油(DAG)的酶,DAG是下游TCR激活形成的第二信使,DGK的缺失可增強T細胞活性。研究證明了DGKA/DGKB-DKO抗EGFRvIII CAR-T細胞如何增加IFN-γ/IL-2的產生和體外細胞毒性以及誘導對TGF-β和前列腺素E2的抵抗。在膠質母細胞瘤異種移植小鼠模型中,這些CAR-T細胞在腫瘤消退方面也產生了有希望的結果。

CRISPR/CAS9在TCR-T細胞治療中的應用

眾所周知,CAR-T細胞在實體瘤中的作用有限。腫瘤特異性抗原缺乏、腫瘤抗原異質性和腫瘤微環境抑制是其主要原因。與CAR-T免疫療法相比,工程化TCR-T細胞療法在靶向更廣泛的抗原方面具有更大的前景,從而擴大了治療癌癥的范圍。

然而, TCR-T細胞治療的主要問題之一是受體T細胞上存在內源性TCR。內源性TCRs與轉基因TCRs競爭CD3的結合,此外,內源性TCR與轉基因TCR的錯配也可能導致混合TCR二聚體的形成。

為了解決這些問題,CRISPR/Cas9系統被用來把內源性TCR α和β 基因替換成具有人工腫瘤特異性TCR序列的基因。與傳統的TCR-T細胞相比,敲除內源性TCR可提高轉基因TCR的表達和功能。此外,動物模型中CRISPR/Cas9修飾T細胞的抗腫瘤反應增強。

為了減少錯誤配對的風險,另一個策略是替換成一個穩定的Vα/Vβ 單鏈TCR(Sc TCR)。據報道,通過CRISPR/Cas9轉導Sc-TCRs幾乎完全消除了TCR錯配。2020年,CRISPR/Cas9編輯的TCR-T細胞首次在難治性癌癥患者中進行了臨床試驗,對安全性和可行性進行評估。通過分離患者自體T細胞,慢病毒轉導表達NY-ESO-1和LAGE-1特異性TCR,然后用CRISPR/Cas9破壞內源性TCRs和PD-1基因。CRISPR修飾的T細胞在體外擴增后回輸3例患者。兩名患者病情穩定,另一名患者病情進展。

CRISPR/CAS9在ACT治療中的臨床現狀

在過去的十年中,許多臨床試驗已經啟動,以評估ZFNs、TALENs和CRISPR基因編輯平臺在多種疾病中的可行性、安全性和有效性,如β-地中海貧血、艾滋病、血友病B、粘多糖病(MPS)、鐮狀細胞貧血和多種惡性腫瘤。

ACT治療癌癥是最近基因編輯試驗的主要焦點之一。中國人民解放軍總醫院的研究人員于2016年開始了第一次CRISPR人類I期臨床試驗(NCT02793856),該試驗在IV期轉移性非小細胞肺癌患者中評估PD-1-KO原代T細胞的安全性和療效。但該研究顯示出較低的非靶向效應,并且沒有嚴重的治療相關副作用,然而,這項研究的有效性并不明確,因為沒有對治療的臨床療效進行調查。同年,開始了另外三項I期臨床試驗,評估IV期膀胱癌(NCT02863913)、轉移性腎細胞癌(NCT02867332)和激素難治性前列腺癌(NCT02867345)中的PD-1-KO原代T細胞,但所有這些試驗后來都被撤回。

TIL和原代T細胞僅構成CRISPR介導的ACT試驗的一小部分,大多數臨床試驗集中于CAR-T/TCR-T細胞。在一項開放性I期研究(NCT03398967)中,評估了CRISPR/Cas9工程化通用CD19/CD22 CAR-T細胞在6例復發/難治性急性淋巴細胞白血病患者中的安全性和有效性。研究顯示,沒有GVHD或基因編輯相關的不良反應,然而,所有患者均出現CRS。該療法還顯示出顯著的抗腫瘤活性,83%的患者在輸注28天后達到完全緩解。

此外,關于T細胞惡性腫瘤,基因編輯可用于消除CD7的表達,這種有吸引力的標記物在T細胞腫瘤中高度表達。Cooper等人設計了功能性UCART7,以在體外/體內消除T-ALL,同時避免GVHD風險;這已成為當前針對T細胞白血病或淋巴瘤患者的臨床試驗的基礎(NCT03690011)。

削弱免疫檢查點的CRISPR/Cas9也正在臨床試驗中進行研究。如通過CRISPR/Cas9破壞PD-1以產生間皮素導向的CAR-T細胞(NCT03747965)和UCART(NCT03545815)進行試驗中。最近的一項臨床試驗正在研究在CD19-CAR-T細胞中使用經編輯的內源性造血祖細胞激酶1(HPK1)的療效;HPK1是一種負性調節TCR激活信號的激酶,因此是一種新的免疫治療靶點。

CRISPR/CAS9在ACT治療中的挑戰和局限性

盡管CRISPR/Cas9在提高免疫治療效果方面顯示出巨大的潛力,但與安全性和有效性相關的一些問題阻礙了其向臨床應用的轉化。

首先,以ACT為基礎的腫瘤免疫治療,包括CAR-T細胞、TCR-T細胞和TILs治療,其臨床療效依賴于足夠的T細胞。然而,大多數用于臨床試驗的CRISPR工程化T細胞通過電穿孔進行轉導,這可能導致細胞損傷并阻礙T細胞體外增殖。因此,病毒載體等更安全、更高效的傳遞途徑亟待探索。

此外,cas9蛋白的免疫原性可能是限制CRISPR/cas9臨床轉化的另一個挑戰。78%和58%的捐贈者中檢測到抗SaCas9和抗SpCas9抗體,這表明人對Cas9蛋白具有預先存在的適應性免疫應答,在CRISPR/Cas9治療患者時可能引起不良反應。

第二,盡管已經報道了各種方法來改進gRNA設計,并增加了Cas酶的特異性,然而由于非特異性而導致的靶外效應風險仍然是將CRISPR/Cas9臨床應用轉化的主要障礙。雖然目前在臨床試驗中,沒有明顯的或只有少量的脫靶位點、染色體重排或缺失,但仍需要更多患者的經驗和更長時間的隨訪來進一步驗證其安全性和可行性。

小結

CRISPR/Cas9是新世紀最重要的發現之一,它將徹底改變世界,治療和消除疾病只是其前景之一。得益于CRISPR,基因治療正在迅速發展。ACT在對抗癌癥方面是一種革命性的方法,然而自推出以來,它一直面臨著許多障礙,如對實體瘤療效有限、T細胞耗竭和功能喪失、異基因T細胞相關GVHD和制造成本等。

多功能的CRISPR平臺雖然并非完美,但有潛力克服ACT面臨的這些障礙。通過利用CRISPR技術消除MHC和內源性TCR表達,與異基因T細胞治療相關的潛在GVHD被最小化;CRISPR還可用于優化T細胞功能,并通過破壞免疫檢查點蛋白減少耗竭;將更有效的治療性T細胞轉化為更低的細胞劑量、更低的毒性和更低的成本。雖然多數臨床試驗仍處于早期階段,但隨著越來越多的臨床試驗的開展,并且一些試驗的初步結果已經證明了可行性和有效性,CRISPR/Cas9輔助ACT癌癥治療的前景值得期待。

參考文獻:

1．CRISPR/Cas9 revitalizes adoptive T-celltherapy for cancer immunotherapy． J Exp Clin Cancer Res． 2021; 40: 269．

2． CRISPR/Cas9 Gene-Editing in Cancer Immunotherapy: Promoting the Present Revolution in Cancer Therapy and ExploringMore． Front Cell Dev Biol． 2021; 9: 674467．