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前言

阿爾茨海默癥（AD）是一種進(jìn)行性、不可逆的神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為認(rèn)知障礙、行為異常和社會(huì)缺陷。據(jù)預(yù)測(cè)，到2050年，美國(guó)65歲及以上老年癡呆癥患者的數(shù)量可能會(huì)達(dá)到1380萬(wàn)。在中國(guó)，超過1507萬(wàn)60歲或以上的老年人患有癡呆癥，其中約983萬(wàn)人患有AD。

目前，AD的發(fā)病機(jī)制還不清楚。β－淀粉樣蛋白沉積和tau蛋白過度磷酸化被廣泛認(rèn)為是AD發(fā)病的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。此外，其他年齡相關(guān)、保護(hù)性和疾病促進(jìn)因素可能與AD的核心機(jī)制相互作用，并可能參與AD的發(fā)病。

近年來(lái)，CRISPR／Cas9的基因編輯技術(shù)發(fā)展迅速，在基礎(chǔ)研究和疾病治療領(lǐng)域顯示出巨大的潛力。最近，基因編輯技術(shù)被評(píng)估為AD研究和治療的一種有前途的方法。CRISPR／Cas9在AD模型構(gòu)建、致病基因篩選和靶向治療等方面具有極大的應(yīng)用潛力。

CRISPR／Cas9系統(tǒng)

CRISPR／Cas9系統(tǒng)本質(zhì)上是一種針對(duì)外源DNA的細(xì)菌防御機(jī)制。CRISPR最初發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)80年代末，是一種由交替重復(fù)和非重復(fù)DNA序列組成的不尋常的遺傳結(jié)構(gòu)。基因組分析表明，CRISPR和Cas蛋白作為獲得性免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用，并通過RNA引導(dǎo)的DNA切割系統(tǒng)保護(hù)原核DNA免受噬菌體和質(zhì)粒DNA的攻擊。

當(dāng)外源DNA侵入細(xì)菌時(shí)，其DNA片段作為間隔子并入CRISPR位點(diǎn)。然后將該位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄到CRISPR前RNA（crRNA），該RNA附著到組成性形成的反式激活RNA（tracrRNA）上，由CRISPR相關(guān)蛋白修飾成gRNA。當(dāng)gRNA與非活性Cas9復(fù)合物的REC I結(jié)構(gòu)域結(jié)合時(shí)，該復(fù)合物被激活，導(dǎo)致gRNA及其互補(bǔ)單鏈DNA形成異源雙鏈。Cas9的HNH和RuvC核酸酶域隨后分別切割互補(bǔ)和非互補(bǔ)DNA鏈。

Cas9屬于1類CRISPR－Cas系統(tǒng)的II型，來(lái)源于化膿鏈球菌。Cas9與靶序列的偶聯(lián)需要一個(gè)原間隔基鄰近基序（PAM），一個(gè)小的入侵基因組中的3－8bp DNA序列，PAM在區(qū)分細(xì)菌自身和非自身DNA以及成功結(jié)合Cas9方面至關(guān)重要。

與ZFN和TALEN不同，ZFN和TALEN依賴于每個(gè)特定基因序列的精細(xì)蛋白質(zhì)產(chǎn)物，CRISPR／Cas9系統(tǒng)依賴于gRNAs，使其成為更靈活的平臺(tái)。Cas9蛋白保持不變，而gRNA可以方便地根據(jù)每個(gè)基因進(jìn)行定制。CRISPR／Cas9系統(tǒng)的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，它使得在多個(gè)基因座上同時(shí)進(jìn)行基因編輯成為可能，與以前的系統(tǒng)相比，它提供了一個(gè)更高效和可擴(kuò)展的平臺(tái)。

CRISPR／Cas9應(yīng)用于AD模型的構(gòu)建

細(xì)胞模型由于不涉及倫理問題，實(shí)驗(yàn)周期相對(duì)短，成本低，因此在包括AD在內(nèi)的各種神經(jīng)疾病的研究中得到了廣泛的應(yīng)用。在過去的幾十年中，建立了許多AD的體外細(xì)胞模型。迄今為止，AD研究中常用的細(xì)胞系包括人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH－SY5Y和SK－N－SH、小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22和膠質(zhì)細(xì)胞BV2以及小鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞N2a。CRISPR／Cas9基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)可以促進(jìn)更有效地開發(fā)AD細(xì)胞模型。

例如，通過CRISPR／Cas9系統(tǒng)下調(diào)HT22細(xì)胞中硫氧還蛋白相互作用蛋白（Txnip）水平可有效減弱β－淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)半胱氨酸氧化修飾。研究結(jié)果表明，Txnip可能是治療AD的一個(gè)治療靶點(diǎn)。

除了構(gòu)建AD細(xì)胞模型外，CRISPR／Cas9技術(shù)還可用于構(gòu)建AD動(dòng)物模型。2020年，Serneels等人通過使用CRISPR／Cas9策略在小鼠和大鼠的APP基因中生成人源化aβ序列（G676R、F681Y和R684H），創(chuàng)建了一個(gè)名為Apphu／hu的新模型。通過在嚙齒類動(dòng)物Aβ序列中插入三種氨基酸，Aβ的水平比原始野生型菌株增加了三倍以上。

CRISPR／Cas9應(yīng)用于AD致病基因的篩選

阿爾茨海默癥分為散發(fā)性（SAD）和家族性（FAD）。APP、PSEN1和PSEN2是引起FAD的主要致病基因，每個(gè)基因的突變都可能導(dǎo)致FAD的發(fā)生。然而，95％以上的AD病例是散發(fā)性的，SAD致病基因的篩選對(duì)于了解AD的分子發(fā)病機(jī)制、早期診斷、風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和治療至關(guān)重要。

高通量測(cè)序和CRISPR／Cas9的發(fā)展為SAD致病基因的篩選提供了很大的幫助。例如，研究發(fā)現(xiàn)，通過CRISPR系統(tǒng)敲除IPSC中的TREM2，小膠質(zhì)細(xì)胞的存活、載脂蛋白E的清除和SDF－1α／CXCR4介導(dǎo)的趨化性都受到嚴(yán)重影響，最終導(dǎo)致對(duì)β淀粉樣斑塊的損傷反應(yīng)。此外，Duan等人設(shè)計(jì)了基于成像的陣列CRISPR，用于研究與AD特征相關(guān)的基因。這也將提供一個(gè)探索AD生物學(xué)的平臺(tái)和藥物發(fā)現(xiàn)的機(jī)會(huì)。

CRISPR／Cas9應(yīng)用于AD的靶向治療

CRISPR／Cas9靶向APP基因突變

APP基因的突變導(dǎo)致Aβ前體蛋白的β－分泌酶切割增加，從而導(dǎo)致顯性遺傳性AD。Gyorgy等人報(bào)告，當(dāng)使用CRISPR／Cas9技術(shù)敲除APP等位基因時(shí)，Aβ蛋白的表達(dá)降低。因此，CRISPR／Cas9系統(tǒng)可能為具有APP突變的AD患者提供基因治療策略。

CRISPR／Cas9靶向Aβ蛋白的關(guān)鍵酶

Aβ蛋白是通過BACE1和γ－分泌酶對(duì)APP進(jìn)行順序修飾形成的。因此，靶向BACE1和γ－分泌酶是治療AD的一種潛在治療策略。Park等人報(bào)告，在兩種AD小鼠模型中，通過使用CRISPR／Cas9成功降低了BACE1的表達(dá)。γ－分泌酶由γ－分泌酶激活蛋白（GSAP）調(diào)節(jié)，Wong等人利用CRISPR－Cas9技術(shù)在穩(wěn)定表達(dá)APP的HEK293細(xì)胞中敲除GSAP，導(dǎo)致Aβ分泌和γ－分泌酶活性顯著降低。

CRISPR／Cas9靶向編輯載脂蛋白E基因型

APOE4亞型是SAD最強(qiáng)的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素。眾所周知，APOE主要由中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。Wadhwani等人關(guān)于APOE4治療靶點(diǎn)的研究表明，當(dāng)通過CRISPR／Cas9方法將兩名AD患者的IPSC中的E4等位基因更正為E3／E3基因型時(shí)，E3神經(jīng)元對(duì)離子霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性不太敏感，并且表現(xiàn)出tau磷酸化的降低。此外，Lin等人利用hiPSC和CRISPR／Cas9技術(shù)鑒定了APOE4的功能，他們的結(jié)果表明APOE4以不同的方式影響Aβ代謝。這些發(fā)現(xiàn)表明APOE4可能是治療AD的一個(gè)有希望的靶點(diǎn)。

CRISPR／Cas9靶向促炎分子

人類基因關(guān)聯(lián)研究表明，免疫反應(yīng)也是AD病因的主要途徑。越來(lái)越多的證據(jù)表明慢性神經(jīng)炎癥在AD中的重要性。CD33是一種免疫調(diào)節(jié)受體，在中性粒細(xì)胞上高水平表達(dá)，在小膠質(zhì)細(xì)胞上低水平表達(dá)，在調(diào)節(jié)AD病理學(xué)的吞噬功能方面具有不同的作用。Bhattacherjee等人的最新研究表明，通過CRISPR／Cas破壞CD33基因，并替換為hCD33的保護(hù)性變體，可以減輕Aβ病理和神經(jīng)退行性變。

膠質(zhì)成熟因子（GMF）是一種新發(fā)現(xiàn)的促炎癥分子，主要在淀粉樣斑塊周圍的反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，并在各種AD腦區(qū)高度表達(dá)。GMF的過度表達(dá)通常通過激活p38 MAPK信號(hào)通路和氧化毒性導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡。Raikwar等人通過CRISPR／Cas9方法成功降低BV2細(xì)胞中的GMF表達(dá)，從而抑制pp38 MAPK以調(diào)節(jié)GMF誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞促炎癥反應(yīng)。

半胱氨酸白三烯（Cys－LTs）是一組炎癥脂質(zhì)分子，通過兩種主要的G蛋白偶聯(lián)受體（CysLT1R和CysLT2R）啟動(dòng)炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明CysLT1R與AD的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，并可通過NF－κB途徑介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。Chen等人證明，通過CRISPR／Cas9系統(tǒng)刪除CysLT1R可減少APP／PS1小鼠的淀粉樣病變并減輕神經(jīng)炎癥。

小結(jié)

基因編輯由于其在科學(xué)研究和疾病治療中廣泛而有效的應(yīng)用前景，近年來(lái)進(jìn)入了一個(gè)蓬勃發(fā)展的時(shí)期。最近，已有許多關(guān)于CRISPR／Cas9介導(dǎo)的AD相關(guān)研究，主要涉及利用該技術(shù)構(gòu)建AD模型、篩選致病基因以及通過特定靶基因（如APP、BACE1、APOE4、CD33、GMF和CysLT1R）治療AD。然而，考慮到該技術(shù)中潛在的非靶向錯(cuò)配和特異性組織靶向性，CRISPR－Cas9最終應(yīng)用于AD的臨床治療仍面臨諸多挑戰(zhàn)。

總之，CRISPR／Cas9作為本世紀(jì)的基因編輯技術(shù)的突破性進(jìn)展，為臨床基因治療開辟了新的途徑。與其他基因編輯技術(shù)相比，CRISPR－Cas9系統(tǒng)具有周期短、細(xì)胞毒性低、價(jià)格低廉、傳遞簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。因此，盡管考慮到仍存在一些缺點(diǎn)，CRISPR－Cas9系統(tǒng)在AD的臨床治療中仍具有廣闊的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

1． Application of CRISPR／Cas9 in Alzheimer’sDisease． Front Neurosci． 2021； 15： 803894．

       原文標(biāo)題 : CRISPR/Cas9在阿爾茨海默癥中的應(yīng)用前景