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  文章背景簡介  

BACKGROUND INTRODUCTION

PIK3CA（phosphoinositide－3－kinase，催化α多肽）基因突變是人類癌癥中最常發生突變的基因之一，已在乳腺癌、結直腸癌、宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌等中發現。此外，PIK3CA突變與癌癥患者的較差生存率有關。在PIK3CA突變中，PIK3CA H1047R基因突變與癌癥的早期診斷、個體化治療和預后相關。因此，檢測具有高特異性和敏感性的PIK3CA H1047R基因突變在癌癥篩查中具有重要意義。

通常，檢測 PIK3CA 基因突變的常規方法包括DNA測序和基于 PCR 的方法。然而，臨床上可用的 DNA 測序只能在野生型 DNA的情況下檢測到0．1％～1％的突變DNA，這對其在臨床實驗室的廣泛應用提出了挑戰。例如，為了提高突變檢測的靈敏度，宋氏課題組提出肽核酸（PNA）介導的PCR特異性鑒別PIK3CA基因突變，靈敏度為0．2％。隨后，丁氏課題組采用等溫以同等靈敏度分析相同突變的擴增策略。然而，這些方法實際上仍然難以檢測同質樣品中的少量突變等位基因。在這種情況下，臨床診斷中的突變分析需要更高特異性和敏感性的策略。

近年來，針對突變位點的高保真識別提出了多種經典策略，如表面連接反應、錯配結合蛋白介導策略、基于分子信標的方法等。事實上，這些策略可以特異性地檢測突變區域以避免復雜的DNA測序，并由于其出色的突變識別能力而廣泛擴展了基因診斷中的突變檢測。但是，這些方法存在一些固有的缺點，例如特異性差和靈敏度低。

作為識別基因突變的替代生物分子，NsbI限制酶作為位點特異性限制酶可以識別特定位點（5＇－TGA GCA） 并切割雙鏈 DNA。目前，NsbI限制性內切酶在電化學生物傳感中用于PIK3CA基因突變檢測的應用尚未見報道。此外，鏈置換擴增（SDA）反應作為靶點循環擴增的有效方法而廣為人知，通過該反應可以有效地獲得DNA拷貝并放大生物信號。

另一方面，各種基于生物傳感的方法，如熒光、比色和電化學方法，已被用于檢測基因突變。在這些方法中，電化學策略因其靈敏度高、成本低、反應快等優點而在基因診斷領域受到越來越多的關注。新興的納米器件已被引入電化學平臺以進一步提高靈敏度，包括金屬納米顆粒、金屬有機框架 （MOF） 和獨特的 DNA納米結構。到目前為止，由于具有放大電化學信號的能力，許多獨特的 DNA 納米結構已被應用于生物傳感器的設計。例如，Chen 和他的同事開發了一種超靈敏的電化學 DNA 生物傳感器，使用遠程自組裝 DNA 納米結構作為信號放大的載體。此外，朱的團隊通過基于發夾組裝的生物傳感器檢測人類端粒酶RNA，將靈敏度提高到 17．0 fM。作為一類新型 DNA 納米結構，通過簡單制造工藝的四通 DNA 連接被選為開發電化學生物傳感器的候選材料，通過這種方法可以捕獲更多的電活性分子，從而顯著增加電化學信號并提高生物傳感器的靈敏度。

生物傳感技術已被開發用于基因突變，以滿足對良好重現性、短時間消耗和高靈敏度的持續要求。受上述啟發，通過將 NsbI－SDA 反應與基于發夾的四向 DNA 連接相結合，研究人員開發了一種電化學生物傳感器，可以超靈敏地檢測 PIK3CA H1047R基因突變。通過這種策略，NsbI－SDA 不僅可以特異性區分 PIK3CA H1047R基因突變，還可以顯著增加DNA拷貝數，而新型四向 DNA 連接可以捕獲大量電活性亞甲藍（MB） 以增強電化學響應。更重要的是，這種電化學生物傳感器可以檢測生物樣品中的低豐度基因突變，在基礎研究和臨床診斷方面都有潛在的應用前景。

2020年，重慶醫科大學Tong Wang等在《Biosensors and Bioelectronics》（生物工程與應用微生物1區 IF＝11．213）發表了名為“An integrated electrochemical biosensor based on target－triggered strand displacement amplification and“four－way” DNA junction towards ultrasensitive detection of PIK3CA gene mutation”的研究論文。

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所用到的主要方法

METHODS  

1． 實驗將 NsbI 限制性內切酶與 SDA 相結合，設計了一種新的均相反應策略，通過該策略識別 PIK3CA H1047R基因的突變位點并改善生物信號。

2．實驗通過簡單直接的自組裝過程制造了一種新型的四向 DNA 連接，以捕獲大量的電活性亞甲藍 （MB） 以增強電化學響應。

3．實驗基于 NsbI 限制性內切酶介導的鏈置換擴增 （NsbI－SDA） 和基于發夾的四向 DNA 連接的新型電化學傳感器可檢測低至0．001％的PIK3CA H1047R基因突變。

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文章主要內容摘要

ABSTRACT

首次基于NsbI限制酶介導的鏈置換擴增（NsbI－SDA）和四向DNA連接構建了一種新型電化學生物傳感器，用于特異性和超靈敏檢測PIK3CA H1047R基因突變。在該生物傳感器中，NsbI限制性內切酶結合鏈置換擴增 （SDA） 能夠特異性區分 PIK3CA H1047R 基因突變和增加 DNA 拷貝數以改善電化學反應。在目標突變基因存在的情況下，由NsbI限制性內切酶切割產生的DNA片段可以觸發SDA反應，產生大量的連接鏈。當連接器鏈被捕獲在電極上時，四向DNA接頭隨后連接到連接器鏈的末端。通過將亞甲藍（MB）的電活性分子整合到四向 DNA 連接中，這種三明治狀電化學生物傳感器能夠以0．001％的低檢出限確定目標突變基因的特異性區別。最后，該策略可用于分析摻入人血清樣本中的突變基因，最后，表明該方法在遺傳分析和臨床疾病診斷中具有潛在的應用價值。

       原文標題 : 生物傳感器對PIK3CA基因突變的超靈敏檢測