01

背景介紹

核糖核酸（縮寫為RNA，即Ribonucleic Acid），存在于生物細胞（主要分布在細胞質中）以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體，是以DNA的一條鏈為模板，以堿基互補配對原則，轉錄而形成的一條單鏈，主要功能是實現遺傳信息在蛋白質上的表達，是遺傳信息向表型轉化過程中的橋梁。

02

實驗流程

一、細胞RNA的提取

研究基因的表達和調控時常常要從組織和細胞中分離和純化RNA。RNA質量的高低常常影響cDNA庫，RT－PCR和Northern Blot等分子生物學實驗的成敗。Trizol是一種總RNA抽提試劑，內含異硫氰酸胍等物質，能迅速破碎細胞，抑制細胞釋放出的核酸酶。

實驗所需試劑和材料：Trizol（4℃保存）、無水乙醇、氯仿（三氯甲烷）、DEPC水、異丙醇（－20℃預冷備用）、移液槍槍頭（RNase－free）、 EP管（RNase－free）。

實驗操作流程：

1．樣品準備：將細胞接種于6孔板中，經干擾和加藥處理后，吸棄培養基，每孔加1mL處理細胞用PBS漂洗細胞兩次。每孔加1 mL TRIzol Regent，4℃；

2．裂解20 min 裂解細胞。之后用移液器輕輕吹打，使裂解物均勻，并用移液器轉移至 RNase－free的1．5 mL離心管中，可放于－80℃保存；

3．超凈臺臺面，實驗所需材料用75％酒精擦拭并紫外照射30min滅菌。通風10min后進行實驗；

4．冰上完全溶解樣品，向每管裂解物中加入200 μL氯仿，蓋好管蓋，上下輕輕顛倒混勻20s，冰浴 5 min；

5．混合物置于 4℃，12000 r／min離心15 min；吸棄上清，置于超凈臺中室溫放置15 min；

6．離心后，樣品分為三層，上層水相為RNA，中層沉淀為蛋白質和DNA，下層為多糖等。小心吸出上層水相400μL（400μL就夠了，建議切勿貪多），轉移到新的EP管中；

7．每1 mL裂解物加400 μL預冷的異丙醇，輕柔顛倒混勻15 s后置于－20℃、1 h沉降RNA；

8．－20℃沉降 1 h 后，沉降體系于4℃，12000 r／min 離心10 min。后打開離心管蓋，將離心管放平，小心傾倒其中液體，保留沉淀；

9．每管1 mL 預冷的 75％乙醇溶液，蓋好管蓋，用力震蕩離心管懸浮沉淀，漂洗沉淀。后于 4℃ 13000 r／min 離心 10 min，吸棄上清，保留沉淀；

10．吸棄上清的離心管倒置于超凈工作臺中，風干10 min；

11．每管加入適量DEPC處理水，溶解RNA沉淀；

12．利用超微量核酸定量儀測定RNA濃度。

注意事項：RNA易分解，實驗在超凈工作臺進行是不需要點燃酒精燈，需避火操作。RNase酶是導致RNA降解的最主要的物質，可以水解RNA的磷酸二酯鍵，廣泛存在于人的皮膚上，因此，在RNA制備有關的分子學實驗時，必須戴手套，并且RNA提取實驗中所使用的移液器和EP管需是RNase－free物品。由于DEPC的劇毒性，實驗室是現在一般槍頭與EP管高壓滅菌3次以上。DEPC水現可由市面上的無菌水／RNase－free水代替。

二、運用M－MLV逆轉錄酶將RNA逆轉錄成cDNA

利用Promega 公司生產的M－MLV逆轉錄酶將RNA逆轉錄成cDNA。反應體系為2 μg RNA，25 μL體系實驗試劑：dNTP（4 ℃保存），M－MLV（－20 ℃保存），RNasin（－20 ℃保存）。

1．超凈臺中取EP管進行標注，按照圖1，每管加入5 μL的隨機引物，同時加入2 μg的RNA模板，混勻后置于70℃的恒溫孵育器中5 min，使得隨機引物與模板鏈孵育結合，然后迅速置于冰上進行冷卻；

2．每管按照5 μL 10 M的dNTP、5 μL的5×Buffer、0．625 μL的RNase inhibitor? 以及1 μL的M－MLV逆轉錄酶（酶放置于冰盒中）配制成預混液，分裝至每個EP管，用DEPC水補齊至終體積25 μL；

3．漩渦震蕩混勻離心之后，置于37℃恒溫孵育器中孵育1 h；

4．調節溫度至70℃終止反應，10min，得到的cDNA至－20℃冰箱中保存備用。逆轉錄的過程中需操作迅速、謹防污染；需注意cDNA 不穩定，切勿反復凍融。

三、實時定量PCR

常規PCR中，擴增產物（擴增子）是通過終點法來分析檢測，即 PCR 反應結束后，DNA 通過瓊脂糖凝膠電泳，然后進行成像分析。而熒光定量 PCR 可以在反應進行過程中進行累積擴增產物的分析和檢測，即“實時”。

在反應體系中加入熒光分子，通過熒光信號的按比例增加來反應 DNA 量的增加，使 PCR 產物的實時檢測成為可能。利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行總量分析或通過Ct值對模板進行相對定量。RT－PCR技術可用于檢測細胞和組織中基因表達水平，克隆特定基因 cDNA序列和檢測RNA病毒。

（1）實時定量PCR具體操作：

按照圖中體系在1．5 mL的EP管中配制反應預混物，漩渦震蕩混勻之后，按照預先安排的順序分裝至八連管中。分裝至八連管之后按照循序加模板，為保證數據的準確性，樣品每組做3個平行，并根據引物的數量設置陰性對照。預混應體系配制過程中全程避光，配好以后置于掌式離心機離心數秒，使所有組分沉降于八連管底部。錫箔紙包住EP板，轉移至Real time PCR反應儀器中，設置反應程序后，點“Start”啟動反應。

（2）連機依次設置參數如下：

a、StepOne Instrument（48 wells）：根據儀器規格選擇48孔／96孔；

b、Quantitation（相對定量）：選擇相對定量的方式，目的基因與內參基因Ct數值；數值；

c、Comparative（△△Ct）：采用△△Ct法對數據進行處理；

d、SYBR Green：所選試劑中的熒光染料為SYBR Green；

e、cDNA：選用的模板為cDNA，進行特異性的擴增；

f、輸入待測靶基因的數目同時輸入相應靶基因名稱；

g、輸入待測樣品的數量、設置平行性個數、靶基因的陰性對照及相應的待測樣品的名稱；

h、設置樣品中的control組及陰性對照組；

i、實時PCR的反應條件如下表所示。

Stage 1

預變性

Stage 2

PCR反應

Stage 3

溶解曲線

95℃ 2 min

95℃ 10 s

60℃ 30 s

40個循環

95℃ 1 min

55℃ 1 min

95℃ 15 s

正確的實驗技巧是成功的熒光定量 PCR 反應重要然而常被忽視的要素。為得到最佳的實驗結果，實驗人員要盡可能減少樣品間交叉污染的可能，避免將核酸從一個實驗帶入下一個實驗。以下措施有助于避免實驗污染問題：

? 在樣品準備和配制反應液過程中勤換手套

? 使用清潔的移液槍

? 只使用 PCR 級的水和 PCR 專用試劑進行 PCR 實驗

? 用帶旋蓋的 EP 管稀釋和配制反應液

四、數據分析

1．RT－PCR結束后，我們可以看到整個擴增階段，分為四個階段，對數據進行一個分析。

2．基線就是擴增曲線中的水平部分。

基線：反應熒光明顯增加前的背景熒光值。默認為3－15Cycles的信號值。

3．閾值：在擴增曲線的指數增長區域內適當位置上設定的熒光檢出界限。

4．CT值是從基線到指數增長的拐點所對應的循環次數。

5．Real time PCR 靈敏性強，故對樣品質量及引物質量要求很高。為避免非特異性擴增導致實驗結果Ct值不準確，建議大家在每次實驗時都要設置溶解曲線程序。只有溶解曲線為單一峰，才能認為實驗數據可靠。

具體計算方式為：

先看Ct值，每個基因的三個平行中，舍去差異較大的值，求出平均值。

求組內△Ct＝組內目的基因 Ct – 內參 Ct

求組間△△Ct＝組間實驗組的△Ct － control組的△Ct

求值：公式（power）＝2－△△C

以上便是從細胞RNA提取到Real Time PCR的全過程，在整個實驗準備及操作過程都需要仔細小心、按要求進行操作，從而增加實驗的成功率。

       原文標題 : 從RNA提取到Real Time PCR