前言

在過去的十年中，使用免疫檢查點抑制劑（ICIs）的癌癥免疫治療在各種惡性腫瘤的治療中顯示出良好的臨床療效。然而，由于免疫抑制性的腫瘤微環境（TME），這種免疫治療效果只使得小部分患者收益。因此，在治療前或治療期間盡早識別可能或不可能對ICI治療產生反應的患者對于獲得最佳免疫治療效果至關重要。

PD－L1的表達最初被認為是預測抗PD－1／PD－L1治療反應的一個可能的生物標志物。然而，僅腫瘤PD－L1陽性不足以對患者進行區分，因為一些PD－L1陰性患者也對免疫治療有反應，并且PD－L1水平在癌癥治療期間表現出時空變化。與ICIs增強臨床益處相關的其他腫瘤因素包括錯配修復蛋白缺陷、微衛星不穩定性（MSI）、高腫瘤突變負荷（TMB）和效應T細胞基因特征。

盡管基于腫瘤組織的生物標記物有助于確定患者是否能夠獲益，但在臨床實踐中仍存在許多挑戰。首先，腫瘤活檢通常是侵入性的，使用活檢獲取患者組織樣本受到腫瘤可及性和患者狀況的嚴重限制。重復的組織活檢可能增加與手術相關的并發癥的可能性，并延遲癌癥治療。此外，由于腫瘤異質性，一個轉移病灶內的局部免疫反應可能并不代表患者的全身抗癌免疫

隨著高通量多通路分析技術的出現，外周血現在適合于更深入的免疫分析。由于外周血取樣容易獲得、微創且可重復，因此使用基于血液的免疫生物標記物可以彌補癌癥免疫治療期間基于組織的免疫生物標記物的上述限制。

循環免疫細胞

外周血循環中存在著各種免疫細胞成分，包括T細胞、B細胞、自然殺傷（NK）細胞或髓系細胞。它們可以幫助預測晚期癌癥患者ICIs的治療反應和臨床益處。利用多色熒光流式細胞術、質譜流式細胞術和下一代測序技術檢測各種免疫細胞亞群的最新技術進展，使得能夠識別和監測外周血中不同的循環免疫細胞亞型。  

CD8＋T細胞

CD8 T細胞被認為是對抗腫瘤的最有效的細胞毒性效應物，是當前癌癥免疫療法的主要靶點。在一項對接受PD－L1抑制劑治療的非小細胞肺癌（NSCLC）患者的研究中，循環中較少CD8＋T細胞與持久的臨床益處（DCB）相關（準確率＝70％）。外周血中循環T細胞數量的減少可能是由于大多數T細胞歸巢到腫瘤組織中。

盡管外周血中循環CD8＋T細胞的總數可能反映整體免疫狀態，但參與癌癥免疫的T細胞亞型非常異質，其中許多不是腫瘤特異性的。因此，在大多數其他研究中，研究人員對T細胞亞型進行了更詳細的分析，而不是測量T細胞總數。

表達PD－1或PD－L1的CD8＋T細胞

PD－1和PD－L1之間的相互作用在腫瘤免疫周期中控制T細胞免疫耐受和耗竭。PD－1過度表達的循環T細胞在癌癥患者中的檢出率高于健康人。

研究發現，在接受nivolumab預處理的NSCLC患者中，基線檢查時，臨床受益患者的PD－1＋CD8＋T細胞檢出率高于無反應患者。此外，最近的一項研究表明，在基線檢查時，較高比例的循環PD－1＋CD8＋T細胞與使用pembrolizumab治療的MSI高胃癌患者的臨床獲益相關。

由于PD－1／L1阻斷可使表達PD－1的CD8＋T細胞恢復活力，并誘導其活化和增殖，因此在幾項研究中已對ICI治療后循環PD－1＋CD8＋T細胞的早期增殖進行了研究。Kamphorst等人觀察到接受PD－1抑制劑治療的NSCLC患者外周血中Ki－67＋PD－1＋CD8＋T細胞的增加，這些增殖性T細胞表現出效應表型。治療后4周內出現早期增殖性T細胞反應的患者，PD－1靶向治療后獲益，而反應延遲或無反應的患者通常會經歷疾病進展。類似地，在使用pembrolizumab治療的晚期黑色素瘤患者中，也報告了PD－1抑制劑治療后Ki－67＋PD－1＋CD8＋T細胞的增加。

總之，ICI治療后循環PD－1＋CD8＋T細胞的早期增殖顯示出作為良好臨床反應和結果的預測性生物標記物的一致潛力。需要進一步的研究來確認哪一個時間點最適合檢測PD－1＋CD8＋T細胞的動態變化。

表達TIM－3的T細胞

除PD－1外，還研究了其他免疫檢查點分子。當對NSCLC和腎細胞癌患者在基線檢查時以及在PD1抑制劑治療開始后至少8周進行配對血樣分析時，與無進展性疾病（PD）患者相比，PD患者表達TIM－3的CD4＋或CD8＋T細胞的頻率顯著增加。此外，TIM－3＋細胞的增加與PFS呈負相關。

然而，在食管鱗狀細胞癌患者中觀察到相反的結果。在食管癌中，第一個周期的nivolumab治療后TIM－3表達的CD4＋或CD8＋T細胞的增加與更高的臨床反應或更長的OS相關。這些有爭議的結果應該在未來的研究中通過更大的樣本量和不同時間點的縱向分析進行驗證。

衰老的CD8＋T細胞

衰老的T細胞表現出終末分化表型，增殖活性低，TCR多樣性池減少，但仍具有細胞毒性潛力，這與耗竭的T細胞不同。CD28的缺失、CD57表達的增加或殺傷細胞凝集素樣受體（KLRG1）的表達常被用作T細胞免疫衰老標記物。

在接受PD－1／PD－L1抑制劑治療的非小細胞肺癌患者中，衰老T細胞增加與不良預后相關。CD8 T細胞中衰老T細胞的臨界值為39．5％，可預測PD－1／PD－L1阻斷的臨床療效（敏感性100％，特異性35％）。具有免疫衰老表型的循環T細胞可能是ICI治療結果的潛在預測性生物標志物。

記憶T細胞

T細胞識別抗原后經歷自然分化，并根據以下表面標記物進行表型細分：幼稚T細胞（TN，CD45 RO－CCR7＋），中心記憶T細胞（TCM，CD45 RO＋CCR7＋），效應器記憶T細胞（TEM，CD45 RO＋CCR7?）， 和終末效應T細胞（TTE，CD45RO－ CCR7－） 。處于每個分化階段的T細胞在ICI誘導的抗腫瘤免疫中具有獨特的作用，并顯示出作為ICI治療結果預測性生物標記物的各種潛力。

一些研究已經報道了TCM細胞在ICI治療反應中的預測潛力。循環CD4＋TCM細胞似乎與接受抗PD－1抑制劑的NSCLC和RCC患者的良好反應和更好的預后相關。其他研究揭示了TEM細胞在預測ICIs臨床益處方面的潛在作用。在使用PD－1抑制劑治療的黑色素瘤患者中，觀察到應答者的循環CD8＋TEM細胞頻率較高，CD4＋TEM細胞和幼稚CD8＋T細胞頻率較低。在使用抗CTLA－4抗體ipilimumab治療的黑色素瘤患者中也報告了一致的結果。

總的來說，在預測ICIs反應時，可以考慮外周血特定分化階段的記憶T細胞。

PD－1＋CD8＋T細胞的TCR克隆性和多樣性

一些研究人員關注TCR克隆性在循環T細胞中作為ICI反應的預測決定因素的作用。在非小細胞肺癌中，不僅在腫瘤組織內，而且在循環T細胞中觀察到顯性TCR擴增， ICI應答者血液中出現早期和持續的TCR克隆擴增。

此外，TCR多樣性是PFS和OS的獨立預后因素。PD－1＋CD8＋T細胞較高的TCR多樣性可能反映出新抗原識別的較高概率。ICI給藥后，腫瘤特異性T細胞的顯性克隆擴增顯示出良好的臨床反應。

監測TCR系統有助于預測ICI的益處。然而，ICI治療后外周血中TCR克隆的擴增可能不能完全反映腫瘤內TCR庫的真實多樣性，也可能不足以抑制腫瘤生長。研究表明，ICI治療的腫瘤反應不僅需要TCR基因庫的克隆擴展，還需要腫瘤獲得足夠的TCR。因此，治療后TCR克隆在血液和腫瘤中的擴增對于ICIs的治療反應至關重要。

CD4＋T細胞

CD4 T細胞可以通過支持CD8＋T細胞的啟動、遷移和存活來促進抗腫瘤免疫。此外，功能性CD4＋T細胞對于在抗PD－1／PD－L1治療后恢復CD8＋T細胞的細胞毒性是必要的。在接受PD－1／PD－L1抑制劑治療的NSCLC患者中，外周血基線較高的高分化CD4＋T細胞（CD27－ CD28low／negative）比例（＞40％）可預測客觀RR，具有100％的特異性和70％的敏感性。

最近的一份報告顯示，CD62 LlowCD4＋T細胞與NSCLC患者對nivolumab的臨床反應相關。與無應答者相比，nivolumab應答者在基線時的CD62 LlowCD4＋T細胞循環水平更高（p＜0．001）。

總之，CD4＋T細胞免疫的內在功能可能是恢復抗腫瘤免疫和預測ICIs治療患者預后的關鍵因素。

免疫抑制細胞：MDSCs和Treg

MDSCs是一組異質性的髓系細胞，不能分化為粒細胞、巨噬細胞或樹突狀細胞。它們通過抑制T細胞和NK細胞、刺激Treg顯示免疫抑制活性，并在各種惡性腫瘤中發揮重要作用。

MDSCs分為兩種表型：粒細胞性MDSC（G－MDSCs）和單核細胞樣MDSC（M－MDSCs）。一項研究檢測了接受ipilimumab治療的黑色素瘤患者循環中的M－MDSCs。與健康志愿者相比，黑色素瘤患者在基線檢查時的M－MDSCs發生率更高。

由于MDSCs與中性粒細胞具有共同的特征，因此很難明確區分。最近，凝集素型氧化低密度脂蛋白受體－1（LOX－1）被認為是癌癥患者的MDSCs特異性標記物。最近的一項研究檢測了nivolumab治療的非小細胞肺癌患者中表達LOX－1的MDSCs和Treg。在探索性隊列中，外周血中LOX－1＋PMN－MDSCs的基線水平在應答者和非應答者之間沒有差異，而應答者的Treg水平高于非應答者。有趣的是，nivolumab治療后應答者中LOX－1＋PMN－MDSCs的水平顯著降低，但在LOX－1＋PMN－MDSCs和Tregs之間存在負相關。因此，PD－1抑制期間Tregs和PMN－MDSC的相對變化有助于預測ICI治療的良好反應和更好的預后。

此外，關于Treg，結果存在爭議。一些研究顯示正相關，而另一項研究報告了負相關，其他研究報告Treg與ICI結果之間沒有關系。因此，Treg的臨床意義需要進一步研究。

自然殺傷細胞

在ICI治療期間，NK細胞在沒有抗原致敏的情況下誘導適應性免疫反應。有研究表明，與無反應組相比，受益于nivolumab治療的NSCLC患者組的CD56＋NK細胞具有更高的細胞毒性表型。在本研究中，循環NK細胞的高基線水平與OS延長相關。然而由于樣本量小，需要進一步驗證。

細胞因子和可溶性蛋白

細胞因子是釋放到體循環中的免疫信號蛋白，主要在局部細胞水平發揮作用。各種報告已證明使用可溶性因子，如IL－6、IL－8、可溶性CTLA－4（sCTLA－4）、可溶性PD－1（sPD－1）、可溶性PD－L1（sPD－L1）、CRP和LDH，作為免疫治療反應的預測或預后因子。這些細胞因子和可溶性檢查點分子可以很容易地使用ELISA進行測量，從而有助于對多個外周血樣本進行自動化、高靈敏度和準確的分析。

IL－6

IL－6由多種細胞分泌，包括免疫細胞和腫瘤細胞。它通過抑制癌細胞凋亡和促進腫瘤血管生成來促進腫瘤進展。在之前的一項研究中，接受IL－2免疫治療的晚期黑色素瘤患者血清IL－6水平越高，OS越短。另一方面，抗PD－1／PD－L1治療后IL－6水平降低與非小細胞肺癌患者的PFS改善相關，并與CRP水平變化相關。

IL－8

IL－8是CXC趨化因子家族的成員，對中性粒細胞趨化性非常重要。在多種腫瘤類型中，IL－8由腫瘤細胞和腫瘤基質細胞分泌。

Sanmamed等人報告，接受抗PD－1治療的黑色素瘤和NSCLC患者在治療早期血清IL－8水平降低與更長的OS相關。此外，他們還表明血清IL－8水平與腫瘤IL－8的產生相關。此外，血清IL－8水平可以正確區分放射學假進展和真實疾病進展。

另一項研究中證明了IL－8在1445例尿路上皮癌（UC）和腎細胞癌患者中的預測作用。在這項研究中，血漿IL－8的高基線水平與atezolizumab治療UC和RCC的療效降低和不良預后顯著相關。

IL－10

IL－10在癌癥免疫中起著多樣性作用。它通常被認為是一種促進腫瘤生長的免疫抑制因子，而最近的研究表明，外源性IL－10給藥可通過促進CD8＋T細胞介導的抗腫瘤免疫而誘導抗腫瘤效應。在實體惡性腫瘤和血液惡性腫瘤中，高水平血清IL－10與較差的生存結果相關。

可溶性CTLA－4（sCTLA－4）

最近的研究試圖闡明可溶性檢查點分子在免疫調節中的作用。sCTLA－4主要由Treg分泌，sCTLA－4可以在正常人血清中檢測到，但在許多癌癥類型中其水平升高。

Pistill等人證明，與血清sCTLA－4水平較低的黑色素瘤患者相比，基線時血清sCTLA－4水平較高（＞200 pg／mL）的黑色素瘤患者經ipilimumab治療后具有更好的ORR和OS，表明血清sCTLA－4可作為預測對ipilimumab反應的生物標記物。有趣的是，較高的基線sCTLA－4水平與更頻繁的免疫相關不良事件發生相關，尤其是在胃腸道。

可溶性PD－1（sPD－1）或PD－L1（sPD－L1）

腫瘤細胞和成熟DC產生并釋放sPD－L1。然而，sPD－L1作為預測性生物標記物的潛在用途仍有待確定。Ugurel等人報道，黑色素瘤患者的sPD－1和PD－L1水平高于健康對照組。他們發現，在轉移性黑色素瘤患者中，基線水平升高的sPD－1和sPD－L1水平與PD－1阻斷的不良反應相關。此外，與sPD－1和／或sPD－L1水平較高的患者相比，基線時水平較低的患者的PFS和OS更長。同樣，其他研究也表明，sPD－1或sPD－L1的基線水平較高與黑色素瘤ICI治療的不良臨床結果相關。

CRP

CRP是由肝細胞產生的血清炎癥蛋白。其血清水平在大多數炎癥反應中迅速升高，據報道，CRP水平升高與癌癥風險增加相關。有研究表明，在使用PD－1抑制劑治療的癌癥患者中，基線時的高CRP水平與不良的PFS和OS相關。另一方面，最近的一項研究表明，CRP flare反應（CRP在治療早期迅速升高，然后在治療后不久下降）與使用nivolumab治療的RCC患者的更好臨床結果相關。

乳酸脫氫酶

基線血清LDH水平通常被認為是晚期黑色素瘤患者接受ipilimumab或pembrolizumab治療后OS縮短的獨立預測因素。一些研究表明，在接受免疫治療的各種惡性腫瘤患者中，高基線血清LDH水平與較差的抗腫瘤反應相關。

循環腫瘤細胞和腫瘤細胞衍生因子

循環腫瘤細胞（CTC）

CTC是從腫瘤組織中分離出來并在血液中自由循環的癌細胞。由于CTC與整體腫瘤負擔、腫瘤侵襲性和血行轉移的可能性密切相關，CTC的存在是各種癌癥類型中一個獨立的不良預后因素。因此，使用液體活檢進行CTC測量用于癌癥診斷、分子分析和治療反應監測。

Tamminga等人報道，在基線檢查時或ICI治療開始后4－6周，三分之一的晚期NSCLC患者中檢測到CTC。他們還表明，有CTC的NSCLC患者的PFS和OS比沒有CTC的患者更差。有趣的是，大約50％的NSCLC患者在兩個時間點都沒有CTC，或者在ICI治療期間CTC減少，顯示出持久的治療反應。因此，分析CTC的頻率和動力學，特別是在沒有可用腫瘤組織的NSCLC患者中，可以幫助預測ICI治療的早期反應。

ctDNA

DNA可以從凋亡或壞死的腫瘤細胞釋放到體循環中。這種腫瘤來源的循環DNA，ctDNA，半衰期短，可作為實時生物標記物用于監測ICI治療后的免疫反應。

在使用抗PD－1抗體durvalumab治療的NSCLC和UC患者的回顧性研究中，ctDNA變異等位基因頻率（VAF）的變化與臨床結果相關，治療開始后6周ctDNA VAF的早期降低與更長的PFS和OS相關。

另一項研究還顯示，在接受一線pembrolizumab±化療的晚期非小細胞肺癌患者中，基線檢查和首次治療取樣之間ctDNA等位基因頻率的降低與較高的RR、較長的PFS（8．3 vs 3．4個月，p＝0．0007）和較長的OS（26．2 vs 13．2個月，p＝0．008）相關。總之，ICIs治療患者的早期ctDNA變化可作為一種潛在的生物標記物，用于捕捉早期免疫反應和生存結果。

血液TMB

TMB是腫瘤新抗原增加的替代標記物，因此用于預測抗PD－1／PD－L1治療的臨床益處。Wang等人報道，使用癌癥基因組NCC－GP150估算的血液TMB（bTMB）與使用全外顯子組測序計算的組織TMB高度相關。在接受抗PD或抗PD－L1抗體治療的NSCLC患者中，bTMB≥ 6與較高的應答率（39．3％ vs 9．1％，p＝0．02）和較高的PFS（HR 0．39，p＝0．01）相關。

因此，bTMB是預測非小細胞肺癌患者臨床預后的一個可行的生物標志物，有必要確認它是否也適用于非小細胞肺癌以外的其他適應癥。

外泌體

外泌體是從各種細胞釋放的細胞外小泡，含有蛋白質和核酸等生物活性物質。最近，研究表明PD－L1可以通過外泌體從腫瘤細胞傳遞到其他細胞。因此，外泌體可對抗腫瘤免疫反應產生負面影響。

一項研究顯示了外泌體在晚期黑色素瘤患者中的預測作用。在腫瘤源性外泌體上PD－1和CD28基線表達較高的患者與表達較低的患者相比，PFS和OS更長。此外，治療前后DC衍生外泌體上CD80和CD86分子的增加與ipilimumab的臨床療效相關。

總的來說，循環外泌體在抗腫瘤免疫反應中可作為重要的免疫調節因子，并具有作為ICI治療預測性生物標記物的潛在價值。

小結

外周血生物標志物在免疫腫瘤學領域迅速出現。它們不僅反映了腫瘤生物學，還提供了關于不斷變化的宿主對腫瘤免疫反應的深入信息。許多轉化研究已經證明了ICI治療期間各種血液生物標志物的預后或預測價值。這些結果使我們能夠更好地理解ICI治療過程中癌細胞與宿主免疫系統之間復雜而動態的相互作用，并且至少在一定程度上有助于區分將對ICI治療產生積極反應的患者與不會產生積極反應的患者。

由于不同的癌癥可能在TME內具有不同的免疫抑制細胞和細胞因子，并且不同的ICI可能具有不同的免疫作用機制，因此生物標記物的特異性可能因癌癥類型和ICI而異。因此，ICIs的生物標記物開發和優化應針對每種癌癥類型和藥物的免疫學特征而定。此外，由于外周血分析采用了各種復合分析法，因此這些分析方案及其報告方法需要標準化，還需要對每種分析法的采樣時間點、敏感性和特異性進行額外的研究，以確保其臨床適用性。

參考文獻：

1．Peripheral Blood－BasedBiomarkers for Immune Checkpoint Inhibitors． Int J Mol Sci． 2021 Sep；22（17）： 9414．

       原文標題 : ICI治療的外周血生物標志物