前言

Toll樣受體9（TLR9）是Toll樣受體家族的成員之一，其可被病原體來源的非甲基化磷酸胞苷鳥苷DNA（CpG DNA）或人工合成的含非甲基化CpG的寡核苷酸（CpG ODN）激活，并通過其下游信號傳導直接或間接啟動固有免疫反應，從而抵抗病原體的入侵。

長期以來，TLR9一直被認為是位于內溶酶體中的細胞內DNA傳感器。然而，隨著研究的深入，發現TLR9也可以在細胞膜表面表達，如中性粒細胞、B細胞甚至紅細胞，被稱為表面TLR9（sTLR9）。此外，細胞免疫反應的激活可以在細胞內外的這兩個TLR9位點啟動，TLR9在細胞膜上的定位有助于激活內體TLR9（eTLR9）介導的信號通路。sTLR9的存在可能有利于某些細胞類型或組織中的宿主反應，例如紅細胞可以通過sTLR9介導巨噬細胞等先天免疫細胞的激活，從而在炎癥狀態下加速自身的清除。因此，深入了解sTLR9的結構特征、sTLR9與CpGDNA的關系，以及sTLR9在免疫細胞中的免疫調節作用，將為TLR9激動劑的臨床應用提供理論參考。

sTLR9的結構

sTLR9的結構并不特別清楚，它是否與eTLR9相同也存在爭議。眾所周知，eTLR9屬于I型跨膜蛋白，由細胞外、跨膜和細胞內區域組成。eTLR9的胞外區位于內體中，由25個富含亮氨酸的重復序列（LRR）組成，其N-末端和C-末端分別稱為TLR9-N和TLR9-C。TLR9-N和TLR9-C可以通過天冬氨酸內切酶釋放，該內切酶作用于eTLR9中間的LLR14和LLR15之間的Z環結構域，形成TLR9-N+C復合物，這是eTLR9的活性形式。

然而，sTLR9的結構尚不清楚。一項研究表明，與TLR9-N結合的抗體完全不能與人外周中性粒細胞上的sTLR9結合，這可能表明這些中性粒細胞的sTLR9不是TLR9-N+C復合物的活性形式。而抗全長TLR9和抗TLR9-N的抗體都能識別B細胞上的sTLR9，這表明全長TLR9和TLR9-N存在于B細胞上。此外，識別TLR9-N的抗體可以檢測到樹突狀細胞（DC）上的sTLR9，但檢測不到脾臟中性粒細胞上的sTLR9，這表明DC和中性粒細胞的sTLR9構象不同。這些研究給人的印象是，sTLR9的結構可以是全長無活性形式，也可以是酶水解活性形式，這可能因細胞而異。

sTLR9的轉移

對于細胞內TLR9，它可以位于內質網（ER）或內體的膜上。對于組成性表達TLR9的細胞，如pDC和B細胞，在穩態下，TLR9主要位于ER膜上。然而，當TLR9配體如CpG-ODN刺激時，TLR9可以從ER膜遷移到內溶酶體膜，成為eTLR9。這種重新定位過程依賴于幾種伴侶蛋白，包括Unc93B1、gp96和PRAT4A。Unc93B1是TLR9功能所需的多次跨膜蛋白，是控制TLR9從內質網向內溶酶體運輸的最關鍵的調節因子。Gp96和PRAT4A也與TLR9相互作用，并共同調控TLR9的折疊。

sTLR9也可以在Unc93B1和銜接蛋白2（AP2）的幫助下從細胞表面遷移到內體，成為eTLR9。研究發現，細胞膜表面的Unc93B1通過其C末端YxxΦ基序募集AP2，然后與網格蛋白形成復合物，以幫助sTLR9轉運到內溶酶體膜上。在存在TLR9配體（如CpG-ODN）的情況下，sTLR9向IRF信號通路的偏向與I型干擾素的誘導有關，而sTLR9向NF-κB信號通路的偏向則與炎癥因子的誘導有關。

此外，在人pDC中，DC相關LAMP樣分子（BAD-LAMP）與Unc93B1一起，促進TLR9從IRF信號向NF-κB信號的偏移，最終導致促炎細胞因子的產生。目前，尚不清楚CpG DNA是如何產生啟動TLR9轉運信號的，但據推測，不同位點TLR9數量的失衡可能是觸發TLR9遷移和重新定位的驅動力。

sTLR9與CpG-ODN的關系

到目前為止，sTLR9是否與TLR9配體CpG-ODN結合仍不確定，但對在中性粒細胞、B細胞和紅細胞上表達的sTLR9的幾項研究表明，中性粒細胞上的sTLR9可以直接與CpG-ODN結合并被激活。對HEK293轉染細胞上表達的sTLR9的研究表明，sTLR9參與CpG-ODN刺激中的細胞內信號通路，涉及MyD88、IRAK和TRAF6，表明定位在細胞表面的TLR9具有生物活性。此外，B細胞和紅細胞似乎也有類似的現象。

因此，sTLR9似乎具有識別和結合CpG-ODN的能力，但它是否能直接啟動信號轉導還需要進一步研究。sTLR9是否能夠與TLR9配體結合是一個值得研究的課題，這有助于揭示TLR9在細胞膜表面出現的潛在生理意義，也有助于解釋其在自身免疫性疾病中的可能作用。

sTLR9的免疫調節作用

sTLR9對中性粒細胞和B細胞的免疫調節作用已經得到了相對深入的研究。紅細胞作為人類免疫系統中一種新興的研究前沿，也表達sTLR9，它可以激活先天免疫反應。

中性粒細胞

據報道，中性粒細胞能夠在病原體感染早期通過sTLR9介導先天免疫反應。已經發現，當CpG DNA不能進入內體或eTLR9不能被激活時，表達sTLR9的中性粒細胞可以感知細胞外病原體衍生的CpG DNA，并獨立于eTLR9啟動sTLR9介導的信號傳導。

一些研究表明，sTLR9+中性粒細胞可能在病原體感染中發揮陽性或陰性免疫調節作用，這取決于其位置或時間。一項基于D-半乳糖胺（D-GAL）聯合CpG-ODN誘導全身炎癥反應綜合征（SIRS）小鼠模型的研究表明，sTLR9+中性粒細胞可在炎癥部位產生TNF-α和IL-10。然而，SIRS誘導后1小時收集的sTLR9+中性粒細胞比6小時收集的產生更多的IL-10和更少的TNF-α，這表明炎癥初始階段的sTLR9+中性粒細胞可能更傾向于負向的免疫調節作用。此外，，在腫瘤中，sTLR9+中性粒細胞與免疫抑制分子如PD-L1和IL-10的高表達，以及免疫激活分子如TNF-α和ICAM1的表達減少有關，其比例也隨著腫瘤的進展而增加，提示sTLR9+中性粒細胞具有負性免疫調節特性。通過使用TLR9激動劑下調早期腫瘤中性粒細胞上sTLR9的水平可以抑制腫瘤生長。

總之，無論是炎癥還是腫瘤，中性粒細胞表面sTLR9的存在似乎都是一種分子標記，可以確定其是否發揮積極或消極的免疫調節作用，同時也賦予sTLR9免疫檢查點分子的特征。TLR9可能通過選擇性遷移發揮免疫檢查點或免疫激活的雙重作用，成為中性粒細胞等先天免疫細胞獨特而快速的活性調節模式。

B細胞

最近的研究發現TLR9在B細胞表面表達，并參與B細胞的激活。根據研究報告，與健康對照組相比，膿毒癥患者外周血B細胞中sTLR9的表達顯著增加。sTLR9的激活可以抑制CpG-ODN單獨或與抗IgM抗體聯合誘導的B細胞增殖和CD25表達。在抗IgM抗體結合的B細胞受體（BCR）的情況下，sTLR9轉移到B細胞的脂筏，表明sTLR9可能在B細胞活化過程中分離，并且這種重新定位對于B細胞活化可能是至少部分必需的。

也有研究表明，sTLR9可能是靜息狀態B細胞拮抗eTLR9激活的一種負調控因子。當B細胞通過eTLR9信號被激活時，sTLR9可以幫助eTLR9發揮其功能。此外，在一項研究中發現，在疫苗加CpG-ODN的刺激下，B細胞上的sTLR9內化到細胞并與內涵體膜蛋白共定位，伴隨著B細胞中sTLR9水平的降低和B細胞的活化，揭示了sTLR9在TLR9激動劑的作用下內化為eTLR9。這些數據表明，CpG-ODN介導的B細胞活化的機制之一可能部分在于其誘導sTLR9在B細胞中重新定位，而sTLR9可能是避免TLR9介導過度B細胞激活的負調控因子。

紅細胞

最新研究表明，紅細胞不僅具有運輸氧氣的功能，還具有免疫哨兵的作用，可以及時感知體內病原體或損傷，發揮免疫細胞的功能。有趣的是，TLR9在紅細胞表面表達，這與先天免疫的激活和炎癥狀態下紅細胞的加速清除有關。

入侵人體的病原體和受損細胞都可以釋放CpG DNA，因此體內游離CpG DNA水平升高，在惡性腫瘤、自身免疫性疾病和敗血癥中通常可以檢測到。2018年，一項研究表明，紅細胞是清除CpG DNA和減輕肺組織損傷所必需的。sTLR9在人類和小鼠紅細胞表面表達，并能與大量游離CpG DNA結合。CD47與CpGDNA結合后，紅細胞表面的分子構象發生變化，失去了原來的“不要吃我”的功能。當這些紅細胞穿過包括肝臟和脾臟在內的網狀內皮系統時，它們被巨噬細胞上表達的SIRPα快速識別，然后被巨噬細胞吞噬。因此，紅細胞以自殺傾向的方式清除CpG-DNA，這抑制了過度的炎癥反應，并誘導貧血的發生。盡管如此，能夠表達sTLR9的紅細胞只占很小的比例，它們在免疫調節中的作用仍有待進一步研究。

小結

TLR9可能出現在細胞膜上并作為穩定和功能性受體的可能性特別令人感興趣。發現源自細胞表面TLR9的途徑可能揭示內體TLR9新的功能，增強我們對炎癥或癌癥觸發的理解，并可能發現以前未知的sTLR9受體特異性配體。存在于質膜上的TLR9可以作為治療靶點，幫助我們開發針對難以治療的罕見疾病的新治療方法。

參考文獻

1.Surfacetoll-like receptor 9 on immune cells and its immunomodulatory effect. FrontImmunol.2023 Sep 1;14:1259989

       原文標題 : 免疫細胞表面的TLR9及其免疫調節作用