01

文章背景簡介   

BACKGROUND INTRODUCTION

L-蘇氨酸(Threonine,Thr)是人體自身無法合成，必須從食物中攝取的8種必需氨基酸之一，是蛋白質合成的重要組成成分，廣泛應用于飼料、食品、醫藥等多個領域，常添加到未成熟仔豬和家禽飼料中，是豬飼料中的第二限制性氨基酸和家禽飼料中的第三限制性氨基酸。目前生產蘇氨酸的方法主要有動物蛋白水解和微生物發酵兩種。與前者相比，微生物發酵法具有成本低、污染少等優點。在蘇氨酸生產過程中，大腸桿菌是主要的宿主。這歸因于其簡單的遺傳背景和方便通過代謝工程修飾。此外，它具有生長周期短、細胞強度高、對設備要求低等特點。Thr的高效合成不僅依賴于某一特定限速反應效率的大幅提高，還需要生物合成網絡中多種代謝途徑的平衡，如強化靶代謝流、削弱競爭性分支代謝流、提高細胞外轉運效率等。

代謝通量分析(Metabolic flux analysis, MFA)是一種通過細胞內反應化學計量模型的代謝網絡分析方法，該模型基于偽穩態假設，即所有代謝物的代謝通量分布是在代謝途徑中生產速率和消耗速率之間的動態平衡中估計的。該方法已成功應用于某些氨基酸的代謝分析，并顯著節省了實驗成本。由于代謝途徑中代謝物的合成受多種酶催化反應的控制，因此有必要研究這些酶對碳通量的控制作用。代謝控制理論認為，每一步代謝途徑反應的變化都會引起系統參數的變化，因此代謝途徑中生化反應沒有穩定的限速步驟。

通量控制系數(FCC)和彈性系數構成了代謝控制分析的遺傳理論，描述了整個代謝網絡中的全局參數，是酶活性與代謝通量之間的橋梁。細胞代謝分析的另一種方法依賴于代謝組學技術，通過GC/MS或LC/MS檢測代謝物的變化，準確反映不同條件下的代謝變化。因此，為了探究聯合代謝分析是否可以指導大腸桿菌提高Thr的產量，江南大學生物技術學院的Qiang Yang等人開展了相關研究，并于2022年在《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》雜志（IF=5.7；JCR Q1；中科院工程技術類2區）發表了題為“Combined metabolic analyses for the biosynthesis pathway of L-threonine in Escherichia coli”的文章。

02

所用到的主要方法

METHODS   

（1）補料分批發酵

（2）內標法定量

（3）氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)

（4）高效液相色譜

（5）生物傳感器測定代謝物

（6）考馬斯亮藍G250染色法

03

文章主要內容摘要

ABSTRACT 

目前，工業生產L-蘇氨酸的方法主要是利用大腸桿菌等微生物直接發酵，具有成本低、生產率高的特點。為了闡明大腸桿菌蘇氨酸合成途徑的關鍵代謝特征，為該菌株的代謝調控或工程化提供線索，研究者以菌株W3110為對照對一株L-蘇氨酸高產菌株E.coliTWF001進行了代謝通量、酶控和代謝組學分析。通過GC-MS檢測，對代謝物進行定性和定量分析，結果表明菌株TWF001和W3110在氨基酸、有機酸、脂肪酸、糖、醇等物質含量方面的確存在顯著差異。與對照菌株W3110相比，TWF001的L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-天冬氨酸和脂肪酸化合物含量顯著降低。而TWF001產生的蘇氨酸含量較高，其他副產物氨基酸的碳代謝流量較少。由于環境干擾和基因改造是兩種重要的代謝分析方法，因此選擇在培養基中添加磷酸鹽和比較不同基因型菌株作為兩種候選方法。通過對關鍵節點、酶和生物標記物等重要靶點的鑒定，為菌種的合理設計提供了靶點。最后以該研究中確定的一種生物標志物為例進行代謝調控，證實了聯合代謝分析可以指導大腸桿菌提高蘇氨酸的產量。

簡而言之，本研究的主要內容有：

1、Thr生物合成途徑代謝分析

2、PEPC、PK、G6PD、FBA、MDH等酶可以作為蘇氨酸代謝通量的描述性指標

3、磷酸鹽作為環境干擾物會影響Thr的積累

4、E. coli TWF001和W3110在各代謝物含量方面存在顯著差異

5、在培養基中加入L-谷氨酸,證實L-谷氨酸可能通過將代謝流遷移而不是增加生物量來提高Thr的產量

       原文標題 : 大腸桿菌中L-蘇氨酸生物合成途徑的聯合代謝分析