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文章背景簡介   

BACKGROUND INTRODUCTION

白細(xì)胞介素-6 (Interleukin-6，IL-6)由多種免疫類型細(xì)胞分泌，是一種能與IL-6受體結(jié)合的多效細(xì)胞因子，具有免疫調(diào)節(jié)、參與炎癥反應(yīng)等多種生物學(xué)功能。并且，IL-6具有顯著的臨床意義，在多種疾病或傳染病，如膿毒癥、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、COVID-19患者體液中顯著升高。此外，IL-6的表達(dá)失調(diào)可引起許多疾病或?qū)е录膊�惡化，如加重炎癥病癥，以及通過激活多種信號通路和增強(qiáng)抗凋亡蛋白的表達(dá)來加快癌癥進(jìn)展。IL-6作為信號通路已經(jīng)研究了十多年，目前IL-6抑制劑已被證明可有效治療慢性關(guān)節(jié)炎(JIA)、大動脈炎和巨細(xì)胞動脈炎(GCA)、細(xì)胞因子釋放綜合征(CRS)和其他嚴(yán)重疾病。

重鏈抗體(Heavy chain antibodies，HCAbs)最早由Raymond Hamers-Casterman教授在單峰駱駝中發(fā)現(xiàn)，它們僅由兩條重鏈組成，既缺失了傳統(tǒng)抗體的輕鏈結(jié)構(gòu)，又缺少重鏈抗體恒定區(qū)VHH結(jié)構(gòu)。重鏈中含有的一個可變抗原結(jié)合域(VHH)，稱為納米抗體(Nb )，其結(jié)構(gòu)中含有的互補(bǔ)性決定區(qū)3(CDR3)環(huán)與框架2(FRW2)相互作用以保持Nb結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。與天然抗體相比，Nb FRW2 中有四個親水性標(biāo)記(F37、E44、R45和G47)，增加了Nb的可溶性和單體表達(dá)。因Nb具有分子量小、親和力高、溶解度高、穩(wěn)定性好、滲透性強(qiáng)等特性，使其得到了廣泛的應(yīng)用。但在臨床使用中，非人源化的Nb可能會導(dǎo)致強(qiáng)免疫原性。因此，納米抗體人源化將是推進(jìn)Nb應(yīng)用的關(guān)鍵一步。

為了獲得靶向抑制IL-6的人源化納米抗體，華東理工大學(xué)的Lei Wang等人，開展了相關(guān)研究，并于2024年在《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》期刊（IF=6.064；Q1區(qū)）發(fā)表了題為“Development of a synthetic library of humanized nanobodies for targeted IL-6 inhibition”的文章。

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所用到的主要方法

METHODS   

（1）計(jì)算機(jī)模擬與分析：用計(jì)算機(jī)預(yù)測和評估生物分子（如蛋白質(zhì)、基因等）的性質(zhì)和分析模擬過程的方法。

（2）圓二色光譜(CD)：應(yīng)用最為廣泛的測定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的方法，是研究稀溶液中蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種快速、簡單、較準(zhǔn)確的方法。CD譜的noise.通過測量生物分子對左、右圓偏振光不同程度的吸收差異（稱為圓二色性）來揭示分子的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象信息。

（3）活體熒光成像

（4）流式細(xì)胞術(shù)

（5）重疊延伸PCR：是在PCR的基礎(chǔ)上，采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來的新技術(shù)。

（6）ELISA

（7）共聚焦顯微成像。

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文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT 

IL-6參與炎癥擴(kuò)增、腫瘤進(jìn)展和許多其他疾病的發(fā)展。納米抗體具有結(jié)構(gòu)小、親和力高的特點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)診斷和治療中是一種功能強(qiáng)大、運(yùn)用廣泛的工具。本研究基于已優(yōu)化的能夠進(jìn)行抗體人源化并提高穩(wěn)定性的支架，開發(fā)了一種合成噬菌體展示文庫，該文庫可快速生成高親和力和人源化的納米抗體，無需動物免疫。以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白( EGFP )為代表，證明該文庫產(chǎn)生的人源化納米抗體具有高功能和細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)穩(wěn)定性。然后利用該文庫進(jìn)行抗IL-6的篩選，發(fā)現(xiàn)了一個突出的納米抗體NbL3，它具有高親和力( 22.16 nM )和強(qiáng)穩(wěn)定性，并且在相對較低的濃度下顯著抑制IL -6對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7遷移的作用。NbL3 的強(qiáng)抑制活性為IL -6 靶向干預(yù)策略提供了一種有希望的治療選擇。

簡而言之，本研究的主要內(nèi)容有：

（1）分析了大量的納米體-抗原復(fù)合物，確定了以納米抗體Nb6B9為模板，再進(jìn)行合理設(shè)計(jì)支架及隨機(jī)化改變CDR區(qū)。

（2）通過圓二色性(CD)和HEK293T細(xì)胞的實(shí)時成像來表征納米抗體體外和細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性。

（3）通過計(jì)算機(jī)模擬與分析，合成了涉及所需結(jié)構(gòu)和序列多樣性的引物，進(jìn)行幾次 PCR 循環(huán)，成功構(gòu)建了有效庫容量為3.7 ×109的人源化納米體合成文庫。

（4）使用EGFP對文庫進(jìn)行篩選,評估文庫是否會產(chǎn)生特異性強(qiáng)和功能性高的EGFP結(jié)合物。

（5）利用文庫鑒定并驗(yàn)證靶向IL-6的人源化納米抗體，確定了納米抗體NbL3可顯著阻斷了IL-6和IL-6R與MCF-7細(xì)胞的結(jié)合。

       原文標(biāo)題 : 靶向抑制IL-6人源化納米抗體文庫的建立