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文章背景簡介   

BACKGROUND INTRODUCTION

假單胞菌是革蘭氏陰性需氧細菌，有180多種。假單胞菌廣泛分布于自然界，如土壤、水、食物和空氣中。有莢膜、鞭毛和菌毛。營養要求不高，種類多，與人類感染有關的主要有銅綠假單胞菌(P. arugino.sa)、類鼻疽假單胞菌(P．pseudomallei)、熒光假單胞菌(P．fluorescens)等。銅綠假單胞菌是常見條件致病菌，特別是醫院感染；類鼻疽假單胞菌可引起局部地區（東南亞）人和動物的類鼻疽病；輸入熒光假單胞菌污染血液或血制品，可導致敗血癥或休克。

超過25種假單胞菌與人類和動物的機會性感染有關。不過，盡管假單胞菌的一些致病種會引起安全問題，但許多假單胞菌在工業、醫藥、農業、環保等領域中也有應用價值。例如，可用于植物病原真菌（如雪霉葉枯菌、鐮刀菌、棉花黃萎病菌、炭疽菌等）及病蟲害的生物防控。還可通過其產生的植物整張激素，發揮對對植物生長的促進作用。在環境保護方面，假單胞菌主要可被用于化學農藥的降解、廢水處理、油污處理等。在醫藥方面的研究也有報道，例如，研究有從假單胞菌中分離出具有抗腫瘤活性的大環類酯類化合物OximidinesI 和II，并有利用假單胞菌外毒素與單克隆抗體結合抗腫瘤的報道。

近些年來，CRISPR/Cas系統作為基因編輯工具，已經廣受關注。但事實上，CRISPR/Cas系統本身是原核生物的一種獲得性免疫系統，用于抵抗存在于噬菌體或質粒的外源遺傳元件的入侵。CRISPR/Cas系統是存在于大多數細菌與所有的古菌中的一種防御機制，以消滅外來的質體或者噬菌體的DNA。CRISPR序列是由可以感染原核生物的噬菌體DNA片段衍生來的。它可以檢測并摧毀能引起相似感染的其他噬菌體中相似的DNA，因此對原核生物抗噬菌體至關重要。它是由富含AT-的前導序列與跟隨其后的，被短重復序列隔開的特殊間隔序列（spacer）所組成。這些短序重復序列一般由28-37個堿基對組成（總范圍23-55堿基對）。而spacer一般由32-38堿基對組成（21-72bp）。新的spacer可以在免疫系統被新的噬菌體感染后出現，但是一般整個基因中只有少于50組的重復序列-spacer序列。CAS則是一種核酸內切酶。可以利用CRISPR序列中間隔序列（spacer）對應的RNA指引，識別并且切割特定與其序列互補的DNA鏈。

近年來，人們逐漸發現，假單胞菌的致病性、對物理化學條件的耐受性，甚至微生物代謝和生物循環等方面，與其CRISPR-Cas系統也有密切的相關性。研究表明，CRISPR-Cas系統調節假單胞菌的生物膜生成和聚集行為。

在假單胞菌屬基因組中尋找CRISPR結構具有重要意義，因為它有助于研究這些遺傳元件在各種環境中的多樣性和分布。

2023年6月，蘇利亞大學Ángel Parra-Sánchez等人在《Genes》（SCI基因與遺傳學分區2區，IF=3.5）上發表了題為“Comparative Analysis of CRISPR-Cas Systems in Pseudomonas Genomes”的文章，分析了不同環境下假單胞菌基因組中CRISPR-Cas系統的存在。 

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所用到的主要方法

METHODS   

1、 CRISPR結構的鑒定

2、CRISPR相關基因(CAS)和CAS蛋白的鑒定與比較

3、間隔序列起源和多樣性的確定

4、原間隔物鄰近基序(PAMs)與自靶向的鑒定

5、直接重復序列(DR序列)保守性的測定和RNA二級結構的預測

6、統計分析

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文章主要內容摘要

ABSTRACT 

假單胞菌中有一些是來自陸地的腐生菌，另一些與人類和動物的機會性感染有關。其致病性或代謝方面的因素與CRISPR-Cas有關，對其進行的計算機研究更多地集中在臨床和非環境設置上。

這項研究旨在對假單胞菌基因組中存在的CRISPR-Cas系統進行計算機分析。研究分析了NCBI數據庫中275個假單胞菌的完整基因組序列。從CRISPRdb獲得了CRISPR基因座。利用BLAST對與CRISPR (cas)和cas蛋白相關的基因、間隔序列的起源和多樣性進行了鑒定和比較。利用WebLogo 3.6對自靶向序列、PAM和DR序列的守恒性進行了可視化分析。使用RNAFold和MFold分析了CRISPR-like RNA二級結構預測。結果顯示：在19.6%的假單胞菌中鑒定出了CRISPR結構。總共發現了113個典型的CRISPR序列，其中有18個推測的Cas基因，還有2050個間隔序列，其中52%與噬菌體同源，26%與染色體同源，22%與質粒同源。在CRISPR陣列中未檢測到潛在的自靶向。所有發現的DR序列都能形成熱力學穩定的二級RNA結構。本研究對CRISPR/Cas系統的比較有助于了解臨床和環境相關物種各進化譜系的環境適應性，為非常規CRISPR的細菌分型、可追溯性、分析和探索提供了數據支持。

簡而言之，本文的主要研究內容有：

1、 分析假單胞菌CRISPR基因座。

2、檢測假單胞菌CRISPR陣列是否有自靶向。

3、分析DR序列是否形成穩定的二級結構以及形成二級結構的熱力學參數的計算。

       原文標題 : 假單胞菌基因組CRISPR-Cas系統的比較分析