01

文章背景簡介

BACKGROUND INTRODUCTION

畢赤酵母常用于表達外源蛋白，是一個理想的細胞工廠，因為它能夠達到非常高的細胞密度，并將蛋白質分泌到上清液中，并且畢赤酵母本身分泌的天然蛋白質較少，簡化了下游純化的工藝。增加同源基因的拷貝數量可以使外源蛋白的產量增加。然而，由于蛋白在分泌途徑中會達到飽和，多拷貝克隆和外源蛋白表達兩者之間的關系并不是線性的。因此，研究中需要測定具有不同拷貝數的菌株，以確定蛋白表達量最大的菌株。因此，需要一種快速、簡便的方法來產生具有一定基因拷貝數的菌株。

目前，產生多拷貝克隆的實驗方法有幾種，包括轉化前載體的體外多克隆、利用高濃度抗生素直接篩選轉化子等。采用直接選擇法，在含有較高濃度抗生素的平板上產生的菌落數量往往大大減少，從而會限制獲得的多拷貝菌株的數量。由于直接選擇法生成多拷貝克隆的效率較低，2008年Sunga等人提出了轉化后矢量放大的方法（PTVA）。在PTVA中，細胞不是在平板上直接使用高濃度的抗生素來篩選，而是隨著抗生素濃度的增加來進行篩選，隨著細胞抗生素耐藥基因的拷貝數增加，使細胞適應更高的抗生素濃度。

PTVA已被廣泛應用于畢赤酵母，然而，盡管PTVA比較容易操作，但該方法費時費力。2016年2月5日，倫敦帝國學院（Imperial College London）的Rochelle Aw 和Karen M． Polizzi等人，在《Microbial Cell Factories》雜志（當前IF4．402；工程技術2區）發表了題為“Liquid PTVA： a faster and cheaper alternative for generating multi－copy clones in Pichia pastoris”的文章，描述了一種通過在液體介質中連續傳遞來減少PTVA時間和成本的方法，這種方法能夠很好的獲得包含不同拷貝數的菌株。

02

所用到的主要方法

METHODS

1．轉換后矢量放大技術（PTVA）

轉換后矢量放大技術（PTVA）是指細胞不是直接通過高濃度的抗生素來進行篩選，而是隨著抗生素濃度的增加來篩選多拷貝的一種方法。在篩選的初級階段，抗生素耐藥基因的拷貝數增加，使細胞適應更高的抗生素濃度。因此，在較高的抗生素濃度下存活的菌株也含有較高數量目的基因的完整副本。

2．Q－PCR

3．分光光度法

4．載體構建

03

文章主要內容摘要

ABSTRACT

背景：為了提高畢赤酵母重組蛋白表達的產量，研究人員經常使用多個同源基因拷貝克隆的方法。轉化后矢量放大技術（PTVA）可以有效地在畢赤酵母中生成多拷貝克隆。然而，盡管這種方法相對容易操作、成功率較高，但是這個過程時間周期比較長，與此同時也會花費較多的金錢。

結果：本文開發了一種改良版的PTVA，稱為液體PTVA，這種方法克服了傳統PTVA（在固體培養皿篩選）的缺點，能夠更快、更便宜地選擇多拷貝克隆。轉化后的細胞是在液體培養基中培養的，只是最后的篩選是在瓊脂平板上進行的。這種方法不僅減少了抗生素總體的使用情況，而且提高了克隆擴增的速度。此外，該研究還發現：以單一拷貝的菌株來進行篩選可使兩種PTVA（傳統平板篩選和液體篩選）產生更高的拷貝數菌株。另外，在液體PTVA中使用Zeocin作為篩選抗生素，可以獲得生長速度較高的菌株。

結論：本文創建了一種多拷貝克隆方法——液體PTVA，這種方法可以在12天內完成，而不是傳統的45天，而且花費的成本大約只有先前方法的一半。

▼

相關鏈接

▼

一種新型無標記、多拷貝畢赤酵母過表達載體的構建與應用