引言

在單克隆抗體藥物開發過程中，會經歷各種各樣的降解和修飾途徑，比如氧化、聚集、脫酰胺化等等，需要我們時刻關注。每個抗體都有自己的目標產品概況，也就是它最終要達到的那個理想狀態。而我們的制劑開發，就是要找到一個合適的配方，讓這個抗體能夠穩穩地達到并保持這個目標狀態。怎么知道穩不穩定呢？這就得靠各種分析方法來評估它的穩定性，然后才能給它定個保質期。

說到單克隆抗體的分析工具，色譜法絕對最常用的工具之一，特別是HPLC和升級版的UHPLC。它們就是精密的蛋白質探測器，可以發現那些化學上的小變化，比如哪里被氧化了，哪里脫酰胺化了，或者電荷發生了什么變化。這些變化通常會影響蛋白質的極性或電荷，可以被HPLC檢測到。那如果蛋白質不是自己發生變化，而是跟別人抱團，形成了聚集物呢？這時候就得靠另一種色譜技術，尺寸排阻色譜SEC來分析了。它能根據分子的大小把它們分開，告訴我們樣品里到底有多少單體、二聚體、三聚體，甚至更大的團塊。接下來，我們就具體看看這些色譜方法是怎么工作的。

尺寸排阻色譜

尺寸排阻色譜，簡稱SEC。它的主要任務是給蛋白質測尺寸。想象一下，柱子里填滿了帶孔的小珠子，就像一個篩子。蛋白質分子進來后，如果個頭太大，鉆不進孔里，就只能在表面溜達，跑得快；如果個頭小，能鉆進孔里，甚至鉆得越深，被卡住的時間就越長，跑得就慢。通過比較不同已知大小的標準品跑多快，我們就能估算出樣品中蛋白質的表觀分子量。但是要注意，SEC認的是蛋白質的流體力學體積，也就是它在水里時占的空間大小，而不是它真實的分子量。如果你用一堆標準的球形蛋白來校準，去測量一個長得像麻花一樣的蛋白質，那結果肯定不準。所以，用SEC測分子量，尤其是對于那些長得不規則的蛋白，得打個問號。

為了解決SEC測分子量不準的問題，科學家們想了個辦法，給它裝上眼睛，光散射檢測器。它能在蛋白質跑出來的時候直接測量它的實際分子量，不再依賴于那些球形標準品，算是對形狀依賴性的一個重大改進。但是，在使用SEC這種方法分析的時候，還是會遇到一些挑戰。比如蛋白質有時候不太聽話，喜歡粘在柱子上，這就叫非特異性吸附，導致結果偏低。雖然可以用一些小技巧比如加點異丙醇或者鹽來減少粘連，但這又可能影響蛋白質在水溶液里的真實行為。還有，不同的抗體在低鹽環境下表現還不一樣，有的會跑歪，有的峰形會變得很難看。另外，蛋白質在柱子里被稀釋了，如果它本身在不同濃度下會抱團或散開，那測出來的結果就可能不是原始高濃度樣品的真實情況了。更別提，有些特別大的聚集物可能在過濾樣品時就被攔在外面了，導致我們少算了聚集物的比例。所以，光看SEC還不夠，還得用別的方法比如生物物理方法來交叉驗證，確保SEC測量的準確性。

離子交換色譜

離子交換色譜，簡稱IEX。它是專門根據蛋白質表面帶的凈電荷多少來進行分離。在特定的pH環境下，蛋白質上的氨基酸殘基會帶上正電荷比如賴氨酸、精氨酸、組氨酸或者負電荷比如天冬氨酸、谷氨酸。IEX柱子內部預先固定了帶相反電荷的基團，比如陽離子交換柱CEX帶負電，陰離子交換柱AEX帶正電。當樣品流過時，帶電荷的蛋白質就會被吸附在柱子上。我們通常在低鹽條件下進行，讓蛋白質盡可能多地結合。然后，通過改變流動相的pH值或者逐漸增加鹽濃度，就可以把它們洗脫下來。理論上很簡單，在同一個pH下，帶更多正電荷的蛋白質在CEX上會結合得更緊，需要更高的pH或鹽濃度才能洗下來；帶更多負電荷的蛋白質在AEX上結合得更緊，同樣需要更強的洗脫條件。所以，IEX非常適合用來追蹤那些改變蛋白質凈電荷的修飾，比如脫酰胺化或者琥珀酰亞胺形成，這些都會改變蛋白質的總電荷。

不過，蛋白質并不是簡單的帶電，它們表面坑坑洼洼，有的地方電荷密集，有的地方稀疏。而且，蛋白質還具有柔性。為了最大限度地與柱子上的固定電荷結合，它可能需要扭動身體，調整自己的姿勢。但這需要付出能量代價，有時候蛋白質寧愿不結合，也不愿意扭曲自己。這就導致實際的洗脫順序可能跟我們簡單計算的凈電荷順序不太一樣。為了解決這個問題，科學家們發明了一種新奇的柱子，叫做觸手離子交換色譜。傳統的柱子就像一個個小球表面帶電荷，而觸手柱呢，是在基質上伸出長長的連接臂，把電荷掛在這個臂膀末端。這樣做的好處是，蛋白質可以像握手一樣，輕松地與這些末端的電荷相互作用，而不需要把自己整個身體都塞到柱子表面去。這大大減少了蛋白質構象調整的需求，提高了結合效率和分辨率。

疏水作用色譜

疏水作用色譜，簡稱HIC。蛋白質表面有些區域不喜歡水，也就是疏水區。在高鹽濃度下，水分子會傾向于圍繞這些疏水區形成有序的結構，這其實降低了系統的整體熵，蛋白質為了增加熵，就會傾向于把這些疏水區藏起來，減少與水的接觸。HIC柱子上固定了一些小的疏水基團，比如苯基或者丙基。在高鹽條件下，蛋白質會被這些疏水基團吸引并結合到柱子上。當我們逐漸降低鹽濃度時，水分子重新占據主導地位，疏水相互作用減弱，蛋白質就被洗脫下來。一般來說，那些疏水性更強的蛋白質，需要更低的鹽濃度才能被洗脫下來，所以它們在柱子上停留的時間更長。HIC特別擅長處理那些因為氧化比如色氨酸或蛋氨酸被氧化，或者天冬氨酸異構化而改變了表面疏水性的蛋白質。

反相色譜

反相色譜，簡稱RP-HPLC。它跟HIC有點像，也是利用疏水性，但具體方法不太一樣。HIC是靠降低鹽濃度來減弱疏水作用，而RP-HPLC則是靠往流動相里加有機溶劑，比如乙腈或丙醇。這些有機溶劑會取代一部分水，使得蛋白質與柱子上疏水基團之間的疏水相互作用變得不穩定。疏水性強的蛋白需要更高濃度的有機溶劑才能被洗脫。RP-HPLC最早是用來分離小分子的，后來發現它對肽段特別有效，特別是結合質譜做肽圖分析，能精確找到蛋白質上哪個氨基酸被修飾了。但是對于完整的大分子抗體來說，它的分辨率有限。因為一個化學修飾對整個大分子的疏水性影響可能沒那么顯著。但是通過優化，比如選擇合適的柱子、流動相和梯度，它還是可以用來研究某些特點的化學變化，比如色氨酸的氧化。

       原文標題 : 單克隆抗體分析工具：色譜法