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文章背景簡介   

BACKGROUND INTRODUCTION

上個世紀，外源化學誘導劑和可溶性轉錄因子（TFs）在基因調控中的應用是促進生物技術和合成生物學快速發展的主要動力之一。然而，由于其可逆性有限、誘導劑的轉運基于擴散，存在著潛在的脫靶效應、轉運延遲和毒性等多種缺陷。

光遺傳調控具有無創性、可逆性和高時空分辨率等優點，有效突破了生化調控的限制。研究者將光遺傳工具應用于真核細胞的表達調控。 Yang等人開發了Lighton和Lightoff系統，報道了一個適用于釀酒酵母的只包含一個單體光敏蛋白LVAD的Ylighton系統。它是Lexa-VVD(LevI)和Gal4蛋白(Gal4AD)激活結構域的融合， 以EL222為基礎構建了釀酒酵母光調控基因表達系統，該系統能產生8.49±0.31g/L異丁醇和2.38±0.06g/L 2-甲基-1丁醇。 Wu等人以EL222為基礎，構建了斑馬魚光遺傳表達系統TaEL。Litoralis紅桿菌的光敏蛋白EL222是基于光誘導同二聚反應的系統之一，由222個氨基酸(AA)組成。 EL222的N端為光氧電壓(LOV)結構域，C端為螺旋轉螺旋(HTH)結構域。 當EL222受到藍光照射時，黃素單核苷酸(FMN)與LOV的結合使Jα螺旋偏離LOV，從而釋放HTH，使EL222同二聚并與被稱為克隆1-20 bp(C120)的調控元件結合。在黑暗中，FMN與LOV解離。 LOV回到基態，抑制HTH與DNA的結合， EL222自發逆轉，導致EL222同聚物迅速解聚和失活。

作為真核生物，畢赤酵母（Pichia pastoris）具有真核表達系統的許多優點，如蛋白質加工、折疊和翻譯后修飾等。與其他真核表達系統相比，畢赤酵母表達系統具有更快、更簡單、更便宜、表達水平更高的特點。然而，最常用的誘導劑甲醇具有劇毒和易燃的特性，在生產過程中我們很難對甲醇進行監測。因此，迫切需要探索一種新的調控方法。光遺傳調控可以有效地避免傳統化學誘導劑的缺點，是調控P.pastoris表達的良好方法。

華中科技大學Zhiqian Wang等人，開發了一個名為pBctrl的光開關基因表達系統用于P. pastoris基因工程表達。該系統包括一組專門設計用于匹配P. pastoris中的EL222的光調節啟動子。在定制啟動子的幫助下，藍光激活轉錄因子VP16-EL222在P. pastoris中起作用。最高感應比達到79.7倍。此外，pBctrl系統被證明對基因表達具有可逆、快速、定量和時空控制。當使用重組脂肪酶作為報告基因時，可以觀察到酶的活性和過表達。這種設計易于在實驗室中實施，并提供了一種新穎、快速、無污染的畢赤酵母表達系統的誘導方法。2022年11月，他們在ACS Synthetic Biology期刊（生物2區 IF 5.25）發表了“Design and Characterization of an Optogenetic System in Pichia pastoris”，文章詳細描述了該系統的設計、構建和表征，并對其應用進行了實驗驗證。該研究為畢赤酵母中基因調控提供了一種新思路，具有重要的理論和應用價值。

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所用到的主要方法

METHODS   

1、PBCTRL的構建 

2、倒置熒光顯微鏡觀察

3、共焦熒光成像

4、照明和光學測量

5、酶標儀測量

6、流式細胞術

7、瓊脂平板顯像

8、脂肪酶活性定量測定

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文章主要內容摘要

ABSTRACT 

畢赤酵母（Pichia pastoris）是商品化生產許多有價值蛋白質的主要宿主系統。傳統上，畢赤酵母中的基因表達調控是通過甲醇誘導實現的，但這種方法存在毒性和易燃性等問題。光遺傳技術提供了一種替代和更清潔的基因調控方法。本研究利用光敏蛋白EL222設計了一種新型“單組分”光遺傳系統，在藍光下誘導表達，最高誘導比為79.7倍。該系統具有簡單、高效、可重復性好等優點，并且可以通過合理設計來進一步改進和擴展其應用。本研究為畢赤酵母中基因調控提供了一種新思路，具有重要的理論和應用價值。

簡而言之，本文的主要研究內容有：

1. 基于 el222的 gs115表達系統的設計

2. 藍光誘導單個細胞集落的激活

3. 劑量依賴性激活   

4. 在單細胞水平上評估性能

5. 光開關空間激活

6. pBctrl 系統的時間行為

7.   重組脂肪酶的表達

       原文標題 : 一種畢赤酵母基因工程表達的光遺傳調控系統