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文章背景簡介   

BACKGROUND INTRODUCTION

作為典型的甲基營養酵母之一，畢赤酵母（也稱為Komagataella phaffii）不僅被廣泛用作異源蛋白表達的優良宿主，而且在有效生物合成經濟化合物如nootkatone（諾卡酮）、類胡蘿卜素、葉黃素、蓖麻油酸、透明質酸和達美烯二醇II等方面表現出良好的潛力。

使用甲醇作為碳源是巴斯德畢赤酵母最有利的特性之一。來自甲醇利用（MUT）途徑的幾個啟動子被鑒定為甲醇依賴性強啟動子，如PAOX1（醇氧化酶1的啟動子）、PFLD1（甲醛脫氫酶1的啟動基）和PDAS（二羥基丙酮合酶的啟動子）。相反，PPEX8（過氧化物酶體基質蛋白的啟動子）或PAOX2（醇氧化酶2的激活子）被歸類為弱啟動子。考慮到這些啟動子受到甲醇的嚴格調控，當使用甲醇作為碳源和誘導劑時，它們可用于有效生產外源蛋白。

由于畢赤酵母能夠進行快速和高密度發酵，它不僅被用作異源蛋白表達的優良宿主，而且在小分子化合物的有效生物合成方面表現出良好的潛力。然而，巴斯德畢赤酵母的基礎研究遠遠落后于釀酒酵母，導致缺乏可用的生物元素。特別是，在畢赤酵母中，可用于外源蛋白表達或生物合成途徑構建的強內源性啟動子元件較少。

為了從畢赤酵母鑒定更多可用的內源性啟動子，浙江大學醫學院藥物生物技術研究所Weiwang Dou等人開展了相關研究，并于2021年8月在《Microbial cell factories》（IF=6.4，Q1）發表了題為“Screening and evaluation of the strong endogenous promoters in Pichia pastoris”的文章。

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所用到的主要方法

METHODS   

1、酵母在不同碳源培養基中生長曲線的測定

2、RNA-seq分析

3、實時定量PCR（RT-qPCR）分析

4、PXXX-lacZ載體的構建及酵母轉化

5、β?半乳糖苷酶活性測定

6、β-胡蘿卜素生物合成途徑啟動子庫的構建

7、β-胡蘿卜素產量的測量

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文章主要內容摘要

ABSTRACT 

盡管大多數研究都集中在強啟動子上，但值得注意的是，強啟動子不適合用于某些應用。例如，具有中等表達水平的啟動子有時更適合用于轉運蛋白或伴侶表達。因此，還應重視對具有不同轉錄活性的各種啟動子的研究。該研究基于RNA-seq數據和LacZ報告子系統，篩選出8個在三種常用培養基中表現出較強轉錄活性的新型內源性啟動子，選擇了一種異質性β-胡蘿卜素生物合成途徑來進一步評估這些啟動子的可用性。研究還發現，同時多次使用同一啟動子可以產生顯著的競爭效應，這可能會顯著降低靶基因的轉錄表達水平。

該研究基于RNA-seq和LacZ報告子系統，在三種常用培養基中篩選出8個有助于提高轉錄表達水平和β-半乳糖苷酶活性的強內源性啟動子。其中，P0019、P0107、P0230、P0392或P0785所貢獻的轉錄表達水平在生長的對數期和穩定期基本不變。P0208或P0627的轉錄水平表現出生長依賴性特征（對數期表達水平較低，穩定期表達水平較高）。在生長60小時后，P0208、P0627、P0019、P0407、P0392、P0230、P0785或P0107貢獻的β-半乳糖苷酶活性相對低于PGAP，但高于PACT1。本研究為了評估這些啟動子的可用性，將其中幾個啟動子隨機應用于巴斯德畢赤酵母的異質性β-胡蘿卜素生物合成途徑，這些突變體的β-胡蘿卜素最高產量可達1.07 mg/g。此外，同時多次使用同一啟動子可以產生顯著的競爭效應，這可能會顯著降低靶基因的轉錄表達水平。

該研究中鑒定的新型強內源性啟動子增加了畢赤酵母中可用的啟動子元件的數量。研究觀察到的競爭效應表明，當在一個酵母菌株中同時使用相同的啟動子進行繁殖時，需要仔細的預評估。這項工作也為巴斯德畢赤酵母的工程應用提供了一種有效的策略來識別更多新的生物元素。

簡而言之，本研究的主要內容有:

1、基于RNA-seq篩選不依賴于碳源的潛在強啟動子

2、候選啟動子轉錄活性的比較

3、P0208和P0627是新的生長依賴性啟動子

4、通過異質性β-胡蘿卜素生物合成途徑評估候選啟動子

5、在酵母菌株中多次使用一個啟動子時存在顯著的競爭效應

       原文標題 : 畢赤酵母強內源啟動子的篩選與評價